[發明專利]一種檢測艾滋病治療藥物核苷類逆轉錄酶抑制劑主要耐藥突變位點的引物及其應用

在審

• 申請號: 201610123551.6
• 申請日: 2016-03-04
• 公開（公告）號: CN105624333A
• 公開（公告）日: 2016-06-01
• 發明（設計）人: 葉力;梁浩;蔣俊俊;陳榮鳳;梁冰玉;黃頡剛;臧寧;周波;李旭;韋吳迪;劉潔;趙芳凝
• 申請（專利權）人: 廣西醫科大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 廣西南寧公平專利事務所有限責任公司 45104
• 代理人: 韋錦捷

技術領域

本發明屬于醫學檢測技術領域，涉及艾滋病病毒耐藥突變位點的檢測，尤其涉及一種檢 測艾滋病治療藥物核苷類逆轉錄酶抑制劑主要耐藥突變位點的引物及其應用。

背景技術

艾滋病自1981年發現以來，迅速在全世界蔓延，已成為危害人類健康的重大公共衛生問 題。據UNAIDS報道，截至2014年，全球存活的艾滋病病毒感染者和病人約3670萬，其中 2014年新發感染200萬例。

高效抗逆轉錄病毒治療已廣泛應用于艾滋病患者的臨床治療，目前約有1560萬艾滋病病 毒感染者接受抗逆轉錄病毒治療，極大地提高了患者的生存率。然而，抗病毒治療的人數及 地區的快速擴大也導致艾滋病耐藥毒株的傳播和流行。我國不同地區抗病毒治療人群耐藥發 生率從3％到56％不等。

對于艾滋病初治患者，抗病毒治療方案為2種核苷類逆轉錄酶抑制劑(NRTIs)+1種非 核苷類逆轉錄酶抑制劑(NNRTIs)或2種NRTIs+1種蛋白酶抑制劑(PIs)，分別以HIV病 毒pol基因上的逆轉錄酶和蛋白酶為靶標。艾滋病的耐藥發生在艾滋病病毒pol基因上，主要 分為NRTIs耐藥突變、NNRTIs耐藥突變和PIs耐藥突變。其中NRTIs藥物有齊多夫定、拉 米夫定、扎西他濱等，可誘導產生K65R、M184、T215Y等耐藥突變。

病毒耐藥是導致治療失敗的主要原因之一，采用經濟高效的耐藥檢測方法，及時了解HIV 治療患者的耐藥性，對于提高艾滋病治療效果和控制艾滋病疫情有重要意義。

目前臨床上廣泛使用的耐藥檢測方法是基于測序的基因型檢測，包括直接測序法、克隆 測序分析、連續特異性擴增分析、深度焦磷酸測序等。這些方法雖然操作較為簡單，但缺點 明顯，如檢測時間長、費用高等。

等位基因特異性PCR(ASPCR)是一種快速、準確、低成本的檢測單堿基突變的技術。 它通過設計三條引物，其中一條為通用引物，另外兩條為特異性平行引物，引物的3’末端分 別與突變位點配對或錯配。進行PCR時，模板正確匹配的引物正常擴增，而與模板錯誤配對 的引物沒有擴增產物，從而確定序列的基因型。

發明內容

本發明的目的是使用ASPCR技術，針對主要的NRTIs耐藥突變設計特異性引物，提供 一種快速、靈敏、低成本的檢測艾滋病治療藥物核苷類逆轉錄酶抑制劑主要耐藥突變位點的 引物及其應用。

本發明采取的技術方案如下：

一種檢測艾滋病治療藥物核苷類逆轉錄酶抑制劑主要耐藥突變位點的引物，包括檢測 HIV-1病毒pol基因的突變位點M41L、D67N、K65R、K70R、K70E、M184V、M184I、L210W、 T215Y和T215F的ASPCR引物，每個突變位點均包括一對野生型PCR擴增引物及一對突變 型PCR擴增引物，每對野生型PCR擴增引物或突變型PCR擴增引物均包括一條特異性上游 引物和一條通用下游引物；

對于M41L位點，其野生型PCR擴增引物的上游引物和下游引物分別為SEQIDNO.1和 SEQIDNO.21，其突變型PCR擴增引物的上游引物和下游引物分別為SEQIDNO.2和SEQ IDNO.21；

對于D67N位點，其野生型PCR擴增引物的上游引物和下游引物分別為SEQIDNO.3和 SEQIDNO.21，其突變型PCR擴增引物的上游引物和下游引物分別為SEQIDNO.4和SEQ IDNO.21；

對于K65R位點，其野生型PCR擴增引物的上游引物和下游引物分別為SEQIDNO.5和 SEQIDNO.21，其突變型PCR擴增引物的上游引物和下游引物分別為SEQIDNO.6和SEQ IDNO.21；

對于K70R位點，其野生型PCR擴增引物的上游引物和下游引物分別為SEQIDNO.7和 SEQIDNO.21，其突變型PCR擴增引物的上游引物和下游引物分別為SEQIDNO.8和SEQ IDNO.21；

對于K70E位點，其野生型PCR擴增引物的上游引物和下游引物分別為SEQIDNO.9和 SEQIDNO.21，其突變型PCR擴增引物的上游引物和下游引物分別為SEQIDNO.10和SEQ IDNO.21；