[發(fā)明專利]一種黑曲霉種子培養(yǎng)方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610122783.X
• 申請日: 2016-03-04
• 公開（公告）號: CN105543112B
• 公開（公告）日: 2020-10-02
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 石貴陽;陳堅;胡志杰;李江華;蔣小東;彭艷紅;金賽;孫福新;王寶石;王莉
• 申請（專利權(quán)）人: 江蘇國信協(xié)聯(lián)能源有限公司;江南大學(xué)
• 主分類號: C12N1/14
• 分類號: C12N1/14;C12Q3/00;C12P7/48;C12R1/685
• 代理公司: 江蘇英特東華律師事務(wù)所 32229
• 代理人: 邵鋆

本發(fā)明提供了一種黑曲霉種子培養(yǎng)方法，通過在培養(yǎng)過程中對產(chǎn)酸速率、耗葡萄糖速率或糖化酶活力中的監(jiān)控來選擇移種的時機(jī)；并具體公開了產(chǎn)酸速率、耗葡萄糖速率或糖化酶活力中的測定方法和披露了溶氧濃度對培養(yǎng)過程的影響，解決了現(xiàn)有培養(yǎng)方法中主要依靠觀察黑曲霉菌球大小、形態(tài)來判斷種子的生長狀態(tài)的不足。本發(fā)明的方法培養(yǎng)的種子發(fā)酵結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)差更小，批次間更穩(wěn)定，發(fā)酵轉(zhuǎn)化率提高，發(fā)酵周期明顯縮短。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種黑曲霉種子培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)

檸檬酸是目前產(chǎn)量和消費量最大的有機(jī)酸，廣泛應(yīng)用于飲料、食品及醫(yī)藥等行業(yè)。我國是檸檬酸生產(chǎn)大國，總產(chǎn)能已超過100萬噸。國內(nèi)檸檬酸生產(chǎn)是以黑曲霉作為菌種，以玉米、木薯等淀粉質(zhì)為原料的深層液體發(fā)酵，一般采用二級發(fā)酵。在進(jìn)行發(fā)酵制備檸檬酸之前，通常進(jìn)行一級種子培養(yǎng)，以獲得大量活力高、產(chǎn)酸能力強(qiáng)的黑曲霉菌絲體。

微生物生長過程中，通常對數(shù)生長中后期細(xì)胞活力較高，一般種子培養(yǎng)至對數(shù)生長中后期需要移種。在黑曲霉種子培養(yǎng)過程中，也遵循這一規(guī)律，以便給后續(xù)發(fā)酵提供活力旺盛的菌體。對數(shù)生長期需要測定種子生長曲線來判定。而生長曲線主要通過細(xì)胞濃度來反映，一般是通過測定種子液600nm可見光下吸光度來計算。而黑曲霉種子培養(yǎng)，通常采用玉米液化液等淀粉質(zhì)粗料作為培養(yǎng)基，固形物含量較高，并且黑曲霉菌體以菌球形態(tài)存在，種子液沉降速度快，很難采用吸光度來準(zhǔn)確反映細(xì)胞濃度，因此這一方法很難在黑曲霉種子培養(yǎng)中應(yīng)用。

目前，在發(fā)酵之前對黑曲霉進(jìn)行培養(yǎng)時，通常是通過觀察來判斷黑曲霉的生長是否符合用于生產(chǎn)檸檬酸的發(fā)酵應(yīng)用，但現(xiàn)有的觀察方法主要是通過觀察黑曲霉菌球大小、形態(tài)，來判斷種子的生長狀態(tài)，而移種主要根據(jù)培養(yǎng)時間來確定。該方法很難真實反映出黑曲霉的生長狀態(tài)，并且由于批次間的差異性，以培養(yǎng)時間來確定移種，導(dǎo)致不同批次間種子處于不同的生長階段，并不能保證處于活力較高的生長階段，從而影響后續(xù)發(fā)酵結(jié)果。因此，迫切需要開發(fā)一種能夠準(zhǔn)確反映黑曲霉種子生長規(guī)律的指標(biāo)和以此作為依據(jù)的移種判斷標(biāo)準(zhǔn)，為后續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)提供高活力的種子液。

發(fā)明內(nèi)容

針對上述問題，本發(fā)明提供了一種能夠準(zhǔn)備反映黑曲霉種子生長指標(biāo)和移種時機(jī)的黑曲霉種子培養(yǎng)方法。

在本領(lǐng)域中，除細(xì)胞濃度外，產(chǎn)物生成、底物消耗、以及關(guān)鍵酶的產(chǎn)量等也通常作為微生物種子生長規(guī)律的參考依據(jù)。發(fā)明人在研究中發(fā)現(xiàn)酸生成曲線、葡萄糖消耗曲線、糖化酶活力變化曲線等指標(biāo)在反映黑曲霉種子生長狀態(tài)也可以起到重要的作用。

經(jīng)過大量實驗發(fā)明人發(fā)現(xiàn)產(chǎn)酸速率、耗葡萄糖速率以及糖化酶活力在種子生長過程中分別呈現(xiàn)如下特點：

1）首先，產(chǎn)酸速率、耗葡萄糖速率以及糖化酶活力為0；

2）接著，三項指標(biāo)迅速增加；

3）然后，三項指標(biāo)達(dá)到最大值；

4）之后，三項指標(biāo)逐漸下降；

5）最后，三項指標(biāo)重新降至0。

由此可見，產(chǎn)酸速率、耗葡萄糖速率和糖化酶活力的變化能夠間接反映黑曲霉種子生長規(guī)律，并且產(chǎn)酸速率、耗葡萄糖速率和糖化酶活力達(dá)最大值的時間處于相同的時間段；產(chǎn)酸速率、耗葡萄糖速率或糖化酶活力達(dá)最大值的時間可以作為種子進(jìn)入移種時期的判斷依據(jù)。

一種黑曲霉種子培養(yǎng)方法，其中，該方法包括：將黑曲霉孢子懸液接種至培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，所述培養(yǎng)過程中適時測量產(chǎn)酸速率、耗葡萄糖速率或糖化酶活力中的至少一種，當(dāng)所述產(chǎn)酸速率、耗葡萄糖速率或糖化酶活力達(dá)到最大值后進(jìn)行移種。

產(chǎn)酸速率、耗葡萄糖速率或糖化酶活力，這三個指標(biāo)可以僅測量其中的任意一個作為判斷的標(biāo)準(zhǔn)，也可以測量多項結(jié)果后進(jìn)行結(jié)合判斷。本發(fā)明中產(chǎn)酸速率的測定是通過測定種子罐酸度，再計算出產(chǎn)酸速率的；耗葡萄糖速率是采用生物傳感分析儀進(jìn)行測定的；糖化酶活力采用GB 8275-2009中方法測定的。