[發明專利]一種用于枯草芽孢桿菌基因組編輯的CRISPRCas9系統及其構建方法

有效

• 申請號: 201610122595.7
• 申請日: 2016-03-03
• 公開（公告）號: CN105671070B
• 公開（公告）日: 2019-03-19
• 發明（設計）人: 吳敬;段緒果;張康
• 申請（專利權）人: 江南大學;江南大學（如皋）食品生物技術研究所
• 主分類號: C12N15/75
• 分類號: C12N15/75;C12N15/31
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 耿曉岳

本發明公開了一種用于枯草芽孢桿菌基因組編輯的CRISPRCas9系統及其構建方法，屬于基因工程技術領域。本發明構建敲除質粒PHY300dsrf，該質粒包含特異性靶向目的基因的sgRNA、cas9基因、同源修復臂、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的復制原點及抗性篩選標記。本發明所設計的特異性靶向srfA?C基因的sgRNA，可以指引cas9蛋白在srfA?C基因的特異性位點切割雙鏈，然后再同源修復臂的指導下對基因組進行精確地同源性重組，在斷裂處引入XhoI酶切位點。在對srfA?C基因敲除成功的枯草芽孢桿菌進行上罐發酵培養，泡沫顯著減少，證明該CRISPR/Cas9基因編輯系統可以有效的對枯草芽孢桿菌基因組進行基因編輯。

技術領域

本發明涉及一種用于枯草芽孢桿菌基因組編輯的CRISPRCas9系統及其構建方法，屬于基因工程技術領域。

背景技術

枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)屬于革蘭氏陽性菌，因其易于分離培養，具有較清晰的遺傳背景和良好的分泌性，又無致病性等特點，已成為重要的工業菌種，被越來越多的用于生產抗生素、藥物蛋白和工業酶制劑等。B.subtilis 168是一種實驗室模式菌株，包含有許多突變。目前被工業上使用的菌株如B.subtilisWB600和B.subtilisWB800都是來源于B.subtilis168。本實驗室之前篩選到一種耐熱酸性普魯蘭酶生產菌株，分類命名為芽胞桿菌(Bacillus.Sp)WSH10-03(于2013年1月11日保藏于中國典型培養物保藏中心，菌種保藏號CCTCC NO:M2013012，專利公開號CN103255079A)，后來鑒定是枯草芽孢桿菌。但是B.subtilis WSH10-03在發酵過程中會產生大量的泡沫，使得發酵過程很難控制并且可能造成染菌?？莶菅挎邨U菌在發酵過程中會產生表面活性素(surfactin)，表面活性素是一種兩性分子，它在液體表面的聚集會造成泡沫的產生。srfA-C基因控制著枯草芽孢桿菌表面活性素形成。采用基因操作技術敲除srfA-C基因來減少枯草芽孢桿菌發酵過程泡沫的產生，這無疑具有極大的工業應用前景。

細菌長期生活在充滿噬菌體或者其它病毒的自然環境中，進化出了多種防御系統，CRISPR/CAS系統就是其中之一，比較常見的是Ⅱ型CRISPR-CAS獲得性免疫系統(Streptococcus pyogenes和S.thermophilus)，當噬菌體入侵時，其基因組上的原間隔序列(postospacer)作為新的間隔序列插入到宿主細胞CRISPR序列的起始序列之后，作為第一個間隔序列；當該噬菌體再次入侵時，細菌的CRISPR序列轉錄產生一條長鏈RNA，即crRNA前體(pre-crRNA)，隨后Cas蛋白復合體在tracrRNA(trans-activating crRNA)的協助下剪切產生成熟體crRNAs，最后tracrRNA-crRNA-Cas9復合體識別并剪切與crRNA互補的位點?，F在通常設計1個sgRNA(small guide RNA)來代替trancrRNA-crRNA引導Cas9蛋白。

建立枯草芽孢桿菌的基因編輯系統，將有利于對基因進行敲除等改造。

發明內容

本發明的目的在于提供CRISPR/Cas9基因編輯系統在枯草芽孢桿菌中的建立和應用。利用本發明的CRISPR/Cas9基因編輯系統進行基因編輯，當把sgRNA和Cas9基因表達質粒轉化枯草芽孢桿菌后，sgRNA通過靶序列與基因對應的互補序列配對，sgRNA中的其他序列則形成莖環結構，此結構能為Cas9所識別，然后在PAM(Protospacer-Adjacent Motif)序列上游2-3堿基間將靶基因的DNA雙鏈切斷。斷裂的雙鏈DNA在有同源修復模板的情況下可以通過HDR(homology-directed repair)途徑進行準確的基因組重組。若斷裂發生在編碼區內，并且修復模板在斷裂處插入幾個堿基(非3的倍數)，就會導致修復后的基因閱讀框碼組移動(frameshift)，造成編碼區提前出現終止密碼子。