[發明專利]一種用于枯草芽孢桿菌基因組編輯的CRISPRCas9系統及其構建方法

有效

• 申請號: 201610122595.7
• 申請日: 2016-03-03
• 公開（公告）號: CN105671070B
• 公開（公告）日: 2019-03-19
• 發明（設計）人: 吳敬;段緒果;張康
• 申請（專利權）人: 江南大學;江南大學（如皋）食品生物技術研究所
• 主分類號: C12N15/75
• 分類號: C12N15/75;C12N15/31
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 耿曉岳

1.一種用于枯草芽孢桿菌基因組編輯的CRISPR/Cas9系統，其特征在于，所述CRISPR/Cas9基因編輯系統建立在單個敲除質粒PHY300dsrf的基礎上；所述PHY300dsrf是將同源修復臂連接到PHY300d上得到的；而PHY300d是由Frag1、Frag2、Frag3和Frag4這四個片段連接而成；其中Frag1含有特異性靶向基因的sgRNA雙鏈寡核苷酸序列和PE194溫度敏感的復制原點的基因序列，Frag2包含氨芐青霉素篩選基因及大腸桿菌復制原點p15A，Frag3包含四環素篩選基因，Frag4包含cas9基因；所述sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

2.根據權利要求1所述的CRISPR/Cas9系統，其特征在于，所述CRISPR/Cas9基因編輯系統由三部分依次連接而成；第一部分為特異性靶向基因的sgRNA雙鏈寡核苷酸序列，第二部分含有PE194溫度敏感的復制原點的基因序列、氨芐青霉素篩選基因、大腸桿菌復制原點p15A、四環素篩選基因、cas9基因，其核苷酸序列為SEQ ID NO:1所示的序列；第三部分為待敲除基因的同源修復臂。

3.根據權利要求1所述的CRISPR/Cas9系統，其特征在于，四個片段按照Frag1、Frag2、Frag4、Frag3的順序連接。

4.根據權利要求1所述的CRISPR/Cas9系統，其特征在于，所述PE194溫度敏感的復制原點的基因序列是NCBI GenBank:M17811.1。

5.根據權利要求1所述的CRISPR/Cas9系統，其特征在于，所述氨芐青霉素篩選基因及大腸桿菌復制原點p15A、四環素篩選基因都是以穿梭質粒pHYPLK-β-CGTase為模板擴增得到的。

6.根據權利要求1所述的CRISPR/Cas9系統，其特征在于，所述敲除質粒PHY300dsrf的構建方法如下：

(1)根據枯草芽孢桿菌的基因序列設計用于特異性靶向目的基因的sgRNA；再在目的基因的sgRNA的基礎上設計sgRNA雙鏈寡核苷酸序列，化學合成sgRNA及溫度敏感的復制原點PE194序列；

(2)以穿梭質粒pHYPLK-β-CGTase為模板，PCR獲得氨芐青霉素篩選基因及大腸桿菌復制原點p15A；

(3)以穿梭質粒pHYPLK-β-CGTase為模板，PCR獲得四環素篩選基因；

(4)以質粒pwtcas9-bacterial(Addgene plasmid#44250)為模板，PCR獲得cas9基因;

(5)采用In-Fusion HD Cloning Plus kits將分別含有sgRNA及溫度敏感的復制原點PE194序列、氨芐青霉素篩選基因及大腸桿菌復制原點p15A、四環素篩選基因和cas9基因的四個片段連接起來，得到質粒PHY300d;

(6)以枯草芽孢桿菌基因組為模板，重疊PCR獲得在斷裂處插入XhoI酶切位點的同源修復臂，并連接到PMD18-T載體上;

(7)將上述含有同源修復臂的PMD18-T載體質粒用XhoI酶切，得到帶有酶切位點的同源修復臂片段；將質粒PHY300d用XhoI酶切，然后將帶有酶切位點的同源修復臂片段連入相應酶切位點，得到敲除質粒PHY300dsrf。

7.權利要求1所述的CRISPR/Cas9系統在編輯枯草芽孢桿菌的srfA-C基因上的應用。

8.根據權利要求7所述的應用，其特征在于，所述枯草芽孢桿菌為B.subtilis 168或B.subtilis WSH10-03。