[發明專利]土壤蛋白酶的測定方法

有效

• 申請號: 201610121495.2
• 申請日: 2016-03-03
• 公開（公告）號: CN105784695B
• 公開（公告）日: 2019-03-26
• 發明（設計）人: 隋躍宇;陳一民;焦曉光;張錦源
• 申請（專利權）人: 中國科學院東北地理與農業生態研究所
• 主分類號: G01N21/78
• 分類號: G01N21/78;G01N21/31
• 代理公司: 哈爾濱市松花江專利商標事務所 23109
• 代理人: 侯靜

土壤蛋白酶的測定方法，本發明涉及蛋白酶的測定方法，特別是涉及一種土壤蛋白酶的測定方法。本發明的目的是為了解決測定蛋白酶活性的準確性較低的問題。本發明的土壤蛋白酶的測定方法按以下步驟進行：一、試劑配制；二、配制磷酸鹽緩沖溶液(PBS)；三、配制明膠溶液；四、配制銅鹽溶液；五、土樣的培養；六、測定；七、甘氨酸標準液的配制和標準曲線的繪制；八：結果計算。本發明土壤蛋白酶的測定方法提高了土壤蛋白酶活性測定的準確性。本發明的土壤蛋白酶的測定方法用于蛋白酶的測定。

技術領域

本發明涉及蛋白酶的測定方法，特別是涉及一種土壤蛋白酶的測定方法。

背景技術

蛋白酶能夠將蛋白質、肽類分解為氨基酸，是土壤中的一種重要的胞外酶，該酶具有離體活性，能夠參與土壤的氮素循環。在進入土壤的植物殘體和施入的有機肥料中，含有一定數量的蛋白物質，土壤蛋白酶能對這類物質進行酶促分解，因此，可用蛋白酶來表征土壤的氮素狀況及其轉化進程。

測定土壤蛋白酶活性的方法中——荷夫曼(Hoffmann)方法(也叫銅鹽比色法)，是目前比較常用的測定土壤蛋白酶活性的方法。該方法采用水溶解的1％明膠培養，然后用加入按比例混合好的銅-磷酸鹽溶液，酶解后釋放的氨基酸與銅鹽反應形成藍色復合物，用分光度計進行比色，計算氨基酸含量，進而分析蛋白酶活性。但是該方法存在許多的不足，首先，1％明膠基質培養的效果不夠好，測得的結果不夠穩定，其次，銅磷酸鹽按照一定比例混合好進行反應生成藍色的復合物的效果不夠明顯，導致測定的結果不夠準確。土壤蛋白酶活性測定的過程中受試驗試劑的影響較大，導致目前荷夫曼方法測定蛋白酶活性準確性較低。

發明內容

本發明的目的是為了解決測定蛋白酶活性的準確性較低的問題，提供了一種土壤蛋白酶的測定方法。

本發明的土壤蛋白酶的測定方法按以下步驟進行：

一、試劑配制：分別配制0.10mol/L～0.15mol/L NaOH溶液，0.10mol/L～0.15mol/L KH₂PO₄溶液；

二、配制磷酸鹽緩沖溶液(PBS)：取步驟一配制的NaOH溶液790mL～795mL和KH₂PO₄溶液1000mL～1010mL混合，調節pH至7.40～7.42；

三、配制明膠溶液：將明膠研磨粉碎，并稱取10.0g～10.4g，量取700mL～710mL步驟二配制的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)加熱至80℃～85℃，將研磨好的明膠溶解于加熱后的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)中，溶解后冷卻定容到1L；

四、配制銅鹽溶液：首先配制0.15mol/L～0.17mol/L CuCl₂溶液，再配制0.18mol/L～0.19mol/L Na₂HPO₄溶液，向Na₂HPO₄溶液中加入NaOH用來調節溶液的pH值，使其pH在8.0～8.5；然后配制0.28mol/L～0.29mol/LNa₂B₄O₇(無水四硼酸鈉)溶液，加入0.08mol/L～0.12mol/L鹽酸，用來調節溶液的pH值，使其pH在6.0～6.5，靜置待用；

五、土樣的培養：準確稱取采自田間的農田黑土10.01～10.04g，烘干制成土樣，用孔徑為2mm的篩子過篩，然后將過篩后的土樣置于容器中，用移液管準確加入甲苯4mL±2μL，放置13min～17min，然后加入步驟三配制的明膠溶液39mL～41mL；再用保鮮膜將容器口封好，放置已預熱37℃～38℃恒溫箱中，培養23h～25h；