[發明專利]土壤蛋白酶的測定方法

有效

• 申請號: 201610121495.2
• 申請日: 2016-03-03
• 公開（公告）號: CN105784695B
• 公開（公告）日: 2019-03-26
• 發明（設計）人: 隋躍宇;陳一民;焦曉光;張錦源
• 申請（專利權）人: 中國科學院東北地理與農業生態研究所
• 主分類號: G01N21/78
• 分類號: G01N21/78;G01N21/31
• 代理公司: 哈爾濱市松花江專利商標事務所 23109
• 代理人: 侯靜

1.土壤蛋白酶的測定方法，其特征在于：該測定方法按以下步驟進行：

一、試劑配制：分別配制0.10mol/L～0.15mol/L NaOH溶液，0.10mol/L～0.15mol/LKH₂PO₄溶液；

二、配制磷酸鹽緩沖溶液：取步驟一配制的NaOH溶液790mL～795mL和KH₂PO₄溶液1000mL～1010mL混合，調節pH至7.40～7.42；

三、配制明膠溶液：將明膠研磨粉碎，量取700mL～710mL步驟二配制的磷酸鹽緩沖溶液加熱至80℃～85℃，稱取研磨好的明膠10.0g～10.4g溶解于加熱后的磷酸鹽緩沖溶液中，溶解后冷卻定容到1L；

四、配制銅鹽溶液：首先配制0.15mol/L～0.17mol/L CuCl₂溶液，再配制0.18mol/L～0.19mol/L Na₂HPO₄溶液，向Na₂HPO₄溶液中加入NaOH，使其pH在8.0～8.5；然后配制0.28mol/L～0.29mol/L Na₂B₄O₇溶液，向Na₂B₄O₇溶液中加入0.08mol/L～0.12mol/L鹽酸，使其pH在6.0～6.5，靜置待用；

五、土樣的培養：準確稱取采自田間的農田黑土10.01～10.04g，烘干制成土樣，用孔徑為2mm的篩子過篩，然后將過篩后的土樣置于容器中，用移液管準確加入甲苯4mL±2μL，放置13min～17min，然后加入步驟三配制的明膠溶液39mL～41mL；再用保鮮膜將容器口封好，放置已預熱37℃～38℃恒溫箱中，培養23h～25h；

六、測定：將步驟五培養的土樣過濾，取10mL～12mL濾液于50mL～100mL離心管中，加水10mL～15mL，依次用移液管準確加入步驟四配制的CuCl₂溶液4mL±2μL、Na₂HPO₄溶液8mL±2μL和Na₂B₄O₇溶液8mL±2μL，將離心管蓋好，充分混勻，溶液由藍色變成藍紫色后離心，4000r/min～4500r/min離心4min～5min，離心完畢后，取上清液在分光光度計650nm處測定吸光度值；

七、甘氨酸標準液的配制和標準曲線的繪制：配制甘氨酸標準液，以甘氨酸濃度為橫坐標，測得的吸光度值為縱坐標繪制標準曲線；

八：結果計算：以每克烘干土樣在24h內酶解蛋白質釋放的NH₃-N的質量來表示蛋白酶活性Pro：Pro＝a·V·n/m，式中：a為由標準曲線求的NH₃-N濃度，單位為μg/mL；V為顯色液體積，單位為mL；n為分取倍數；m為烘干土重，單位為g。

2.根據權利要求1所述的土壤蛋白酶的測定方法，其特征在于：步驟五加入甲苯4mL。

3.根據權利要求1所述的土壤蛋白酶的測定方法，其特征在于：步驟五加入步驟三配制的明膠溶液40mL。

4.根據權利要求1所述的土壤蛋白酶的測定方法，其特征在于：步驟六用移液管準確加入步驟四配制的CuCl₂溶液4mL、Na₂HPO₄溶液8mL和Na₂B₄O₇溶液8mL。

5.根據權利要求1所述的土壤蛋白酶的測定方法，其特征在于：步驟七配制甘氨酸標準液按以下步驟進行：精確稱取0.2679g甘氨酸溶于蒸餾水，并準確稀釋至100mL，此為甘氨酸標準溶液，1mL含500μgNH₃-N；用移液管準確吸取甘氨酸標準液10mL于50mL容量瓶中，用水稀釋至刻度，即得100μgNH₃-N/mL的標準液；然后分別吸取稀釋5倍標準液0、2、4、6、8和10mL于50mL～100mL離心管中，加水稀釋至20mL～25mL；依次用移液管準確加入步驟四配制的CuCl₂溶液4mL±2μL、Na₂HPO₄溶液8mL±2μL和Na₂B₄O₇溶液8mL±2μL；將離心管蓋好，充分混勻，由藍色變成藍紫色后離心，4000r/min～4500r/min離心4～5min；離心完畢后，取上清液在分光光度計650nm處測定吸光度值。