[發明專利]微量DNA中甲基化CpG島高通量測序方法

有效

• 申請號: 201610119392.2
• 申請日: 2016-03-02
• 公開（公告）號: CN105695577B
• 公開（公告）日: 2019-03-19
• 發明（設計）人: 陸星宇;宋艷群
• 申請（專利權）人: 上海易畢恩基因科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869
• 代理公司: 上海精晟知識產權代理有限公司 31253
• 代理人: 馮子玲

本發明提供一種微量DNA中甲基化CpG島高通量測序方法，包括步驟：1)將DNA樣品進行亞硫酸鹽處理；2)將步驟1)中獲取的處理樣品加入到含有引物A的PCR體系中進行線性擴增；3)向步驟2)中的PCR產物中加入具有單鏈DNA剪切活性的核酸外切酶，反應后使核酸外切酶失活；4)將步驟3)中的產物加入到含有引物B的PCR體系中進行線性擴增；5)將步驟4)中的產物加入含有相應接頭引物C和接頭引物D的PCR體系中進行擴增；6)將步驟5)中的PCR產物進行純化獲得具有特異長度的DNA文庫，并進行測序。本發明采用多步PCR的方法直接富集微量DNA序列中甲基化CpG島序列對待測目的片段進行高通量測序效率極高。

技術領域

本發明涉及一種微量DNA中甲基化CpG島高通量測序方法，屬于基因測序領域。

背景技術

DNA甲基化是DNA的一種重要修飾堿基，它主要指在胞嘧啶的5號碳原子上進行的甲基化共價修飾，基本存在于所有物種的DNA中。胞嘧啶的甲基化修飾存在于DNA中特殊結構CpG中并在雙鏈中成對出現；在脊椎動物結構基因組中，大部分的CpG結構域主要集中在基因啟動子區域，有約60％～90％的CpG區域中的胞嘧啶上發生甲基化作用。DNA的甲基化會導致DNA構象、穩定性、DNA與蛋白質相互作用的方式以及染色質結構發生改變，進而影響基因的表達調控，使其在細胞發育與分化、特征性表型基因的表達以及X染色體失活等方面發揮著巨大的作用。因而對于基因組中DNA甲基化位點的精準測序是全面理解追蹤基因特征和功能的重要方面。

傳統的單位點甲基化檢測或者測序方法(如限制性酶切，限制新酶切-PCR，甲基化特異性PCR、焦磷酸測序、熒光定量法等方法)受限于技術方法只能一次性檢測單個或者多個位點，且方法比較繁雜；基于芯片的甲基化圖譜可以繪制基因組甲基化圖譜，但該方法需求量較小，且成本較高，不適用于大規模使用。近些年來隨著第二代測序方法的發展，人們可以通過高通量測序的方法進一步系統詳盡準確的認識基因組中甲基化的分布情況。目前基于高通量測序的甲基化測序方法有三種類型：(1)免疫沉淀的方法；(2)亞硫酸氫鹽測序以及(3)甲基化CpG隨機擴增與測序的方法(MCTA-Seq)。免疫沉淀的方法需要購買具有特異性識別效果的抗體，并且該種測序方法只能算得上是半定量，分辨率只能到100bp。亞硫酸氫鹽測序方法的測序方法則能精確到堿基，是甲基化分析的金標準。該種方法是將DNA樣品用亞硫酸鹽進行處理后將未發生甲基化的胞嘧啶轉化為尿嘧啶，然后根據酶切，跑膠純化等步驟富集啟動子以及CpG島區域，進一步建立文庫測序；但該方法程序復雜且耗時長耗費高，性價比較低，不具有廣泛的適用性。甲基化CpG隨機擴增與測序的方法是基于亞硫酸鹽法的改進方法。該方法首先將收集到的DNA樣品進行亞硫酸氫鹽處理獲得轉化后的樣品，然后通過特定引物將特定為發生甲基化CpG富集區域(特別是CpG島區域)進行擴增并建立DNA文庫，進而通過切膠的方法將目標區域片段進行富集，進而實現特定區域的甲基化CpG島測序分析。該方法降級成本且可以有效覆蓋80％以上的CpG島區域，對于DNA中甲基化的分布分析具有重要的意義，但是該方法仍有三個較大的缺陷：1)獲得的DNA文庫始終包含有極大量的引物二聚物與雜質，外加亞硫酸鹽測序方法的局限性，極大的干擾到實際有效測序效果，使之測序成本加大；2)引物能夠捕獲的CpG島區域范圍仍不能覆蓋全部啟動子區域；3)該方法建庫純化步驟仍極為依賴操作者的判斷和技藝，不利于自動化工業化操作。

目前尚缺少一個較為高效的商品化甲基化CpG島高通量測序檢測方法。

發明內容

本發明的目的在于提供一種微量DNA中甲基化CpG島高通量測序方法，

本發明采用了如下技術方案：

一種DNA中甲基化CpG島高通量測序方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)將獲得的微量DNA樣品進行亞硫酸鹽處理，獲取單鏈的經亞硫酸鹽轉換的DNA樣品；

2)將步驟1)中獲取的處理樣品加入到含有引物A的PCR體系中，并在PCR儀器中進行線性擴增；