[發明專利]微量DNA中甲基化CpG島高通量測序方法

有效

• 申請號: 201610119392.2
• 申請日: 2016-03-02
• 公開（公告）號: CN105695577B
• 公開（公告）日: 2019-03-19
• 發明（設計）人: 陸星宇;宋艷群
• 申請（專利權）人: 上海易畢恩基因科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869
• 代理公司: 上海精晟知識產權代理有限公司 31253
• 代理人: 馮子玲

1.一種微量DNA中甲基化CpG島高通量測序方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)將獲得的微量DNA樣品進行亞硫酸鹽處理，獲取單鏈的經亞硫酸鹽轉換的DNA樣品；

2)將步驟1)中獲取的處理樣品加入到含有引物A的PCR體系中，并在PCR儀器中進行線性擴增；

3)向步驟2)中的PCR產物中加入具有單鏈DNA剪切活性的核酸外切酶，于37℃中反應30分鐘，然后升高溫度使所述核酸外切酶失活；

4)將步驟3)中的酶消化產物加入到含有引物B的PCR體系中并進行線性擴增；

5)將步驟4)中的PCR產物體系再加入含有相應接頭引物C和接頭引物D的PCR體系中進行PCR擴增；

6)將步驟5)中的PCR產物進行具有尺寸選擇性的純化方式獲得具有特異長度的DNA文庫，并根據測序儀要求的質控鑒定后進行高通量測序，

其中，所述引物B的3’端最后一個堿基為D，第二、三個堿基緊接著一個CpG富集區，而在4～9個堿基則會包含一個堿基C，其他的堿基為D，D為A或T或G。

2.如權利要求1所述的微量DNA中甲基化CpG島高通量測序方法，其特征在于：

其中，所述引物A的5’端序列可以與測序通用接頭引物C相互退火結合。

3.如權利要求1所述的微量DNA中甲基化CpG島高通量測序方法，其特征在于：

其中，所述引物B中5’端序列可以與接頭引物D退火結合。

4.如權利要求1所述的微量DNA中甲基化CpG島高通量測序方法，其特征在于：

其中，所述引物B的3’端序列包含一段隨機的長為5-15的堿基的退火結合序列，此序列含有0-15個堿基C，0-15個堿基D與0-7個CpG。

5.如權利要求1所述的微量DNA中甲基化CpG島高通量測序方法，其特征在于：

其中，所述引物B的5’端序列和3’端序列則是由4-20個堿基D連接形成。

6.如權利要求1所述的微量DNA中甲基化CpG島高通量測序方法，其特征在于：

其中，所述引物B是單條引物，或者是多條引物的混合。

7.如權利要求1所述的微量DNA中甲基化CpG島高通量測序方法，其特征在于：

其中，引物B是下述四條引物的混合物：

5’-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCATGD DDDDDDDGCGD-3’；其中，D為A或T或G。

5’-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCATGDD DDDDDGDCGD-3’；其中，D為A或T或G。

5’-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCATGDD DDDDGDDCGD-3’；其中，D為A或T或G。

5’-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCATGDD DDDGDDDCGD-3’；其中，D為A或T或G。

8.如權利要求1所述的微量DNA中甲基化CpG島高通量測序方法，其特征在于：

引物C的序列如下：

5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTAC ACGACGCTCTTCCGATCT-3’。

9.如權利要求1所述的微量DNA中甲基化CpG島高通量測序方法，其特征在于：

引物D的序列如下：

5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTGATCGTGACTGGA GTTCAGACGTGTGCT-3’。