[發明專利]中華按蚊烯醇化酶結合蛋白基因及其制備方法

在審

• 申請號: 201610119304.9
• 申請日: 2016-03-02
• 公開（公告）號: CN105695474A
• 公開（公告）日: 2016-06-22
• 發明（設計）人: 張超;顧亞萍;唐建霞;曹俊;高琪
• 申請（專利權）人: 江蘇省血吸蟲病防治研究所
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C12N15/10
• 代理公司: 無錫市大為專利商標事務所(普通合伙) 32104
• 代理人: 殷紅梅;劉海

技術領域

本發明涉及一種中華按蚊烯醇化酶結合蛋白(EBP)基因及其制備方法。

背景技術

瘧疾是由瘧原蟲引起的一種流行廣泛，危害嚴重的蟲媒傳染病，與艾滋病 和結核病一起被列為世界上最具威脅的三大傳染病，在全球100多個國家和地 區流行，30多億人受瘧疾感染危險，每年約有2億多病例，近60萬人死亡。尋 找和研發安全有效的瘧疾疫苗或治療新藥物，將成為全球和我國消除瘧疾的急 迫需求。

與艾滋病和結核病不同的是，瘧疾必須通過媒介按蚊才能進行傳播。瘧疾 是由瘧原蟲引起的，其中，惡性瘧原蟲(Plasmodiumfalciparum)引起的瘧疾主 要由岡比亞按蚊(Anophelesgambiae)和斯氏按蚊傳播，間日瘧原蟲(Plasmodium vivax)引起的瘧疾主要由中華按蚊和斯氏按蚊傳播。中華按蚊(Anopheles sinensis)是瘧疾和馬來絲蟲病的重要傳播媒介，不僅分布于我國除新疆和青海 以外的全國各省區，還在東南亞和西太平洋地區廣泛分布，是水稻種植地區的 優勢蚊種，是我國中部間日瘧流行區的主要傳瘧媒介，在我國的種群數量大。 中華按蚊是我國重要的媒介生物，有效控制中華按蚊對控制相關疾病的傳播具 有重要的意義。

烯醇化酶(enolase)最初發現是細胞糖酵解中的關鍵酶之一，后來發現它 能夠表達在瘧原蟲表面并不依賴于其酶活性通過與按蚊上未知蛋白結合介導瘧 原蟲侵入媒介按蚊，從而在按蚊體內發育成具有感染性瘧原蟲而傳播瘧疾。最 近Vega-RodríguezJ等發現在岡比亞按蚊上與惡性瘧原蟲烯醇化酶(enolase)相 互結合的蛋白enolase-bindingprotein(EBP)，并且發現EBP是惡性瘧原蟲侵入 岡比亞按蚊所必須的，為相關控制岡比亞按蚊傳播惡性瘧藥物開發奠定了基礎。 我國中部間日瘧流行區的主要傳瘧媒介是中華按蚊，為開發相關控制間日瘧藥 物，我們在間日瘧原蟲的媒介宿主中華按蚊上發現鑒定了與間日瘧原蟲烯醇化 酶(enolase)相互結合的蛋白enolase-bindingprotein(EBP)基因序列，與岡比 亞按蚊上與惡性瘧原蟲烯醇化酶(enolase)相互結合的蛋白enolase-binding protein(EBP)序列進行了差異比對，并且對其在中華按蚊各個發育階段和各個 組織分布進行了研究。

發明內容

本發明的目的是克服現有技術中存在的不足，提供一種中華按蚊烯醇化酶 結合蛋白基因及其制備方法。

按照本發明提供的技術方案，一種中華按蚊烯醇化酶結合蛋白基因，特征 是：所述中華按蚊烯醇化酶結合蛋白基因如SEQIDNo：1所示；所述中華按蚊 烯醇化酶結合蛋白基因的氨基酸序列如SEQIDNo：2所示。

所述中華按蚊烯醇化酶結合蛋白基因的制備方法，特征是，包括以下步驟：

(1)采用中華按蚊成蚊mRNA反轉錄獲得cDNA模板；

(2)以cDNA為模板，采用引物F1和F2經PCR反應體系進行擴增；所 述引物F1的序列為：cagtnctnggntgncnttgntcncttcg，其中n為a、t、g或c；所述 引物F2的序列為cgancngntgnttnggnntcacnggntg，其中n為a、t、g或c；

(3)擴增產物進行加尾反應，得到EBP基因部分序列，然后采用引物對 F3和F4、F5和F6擴增EBP3‘和5’端序列；最后使用引物F7和F8擴增出 全長EBP基因。

進一步的，所述PCR反應體系包括：1μlcDNA模板、1μl引物F1、1μl引 物F2、2μl10×buffer、3μl25mMMgCl₂、4μl2mMdNTPs、1μlTaq聚合酶和7μl 水。

進一步的，所述步驟(2)擴增過程為：94℃、4min；94℃、30sec；50℃、 30sec；72℃、1min，共30個循環；72℃、7min；4℃、12min。

進一步的，所述步驟(3)加尾過程為：向步驟(2)的擴增產物中加入0.5 μldATP及普通TaqDNA聚合酶，混勻后置于72℃孵育60min進行加尾反應。