[發明專利]刺參ITGB基因、編碼蛋白及其克隆方法和重組刺參ITGB基因工程菌構建方法

有效

• 申請號: 201610118991.2
• 申請日: 2016-03-02
• 公開（公告）號: CN105713907B
• 公開（公告）日: 2019-05-28
• 發明（設計）人: 李成華;王振輝;張衛衛;邵銥娜;李曄;呂志猛
• 申請（專利權）人: 寧波大學
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C12N15/10;C07K14/705;C12N15/70
• 代理公司: 寧波奧圣專利代理事務所(普通合伙) 33226
• 代理人: 何仲

本發明公開了刺參ITGB基因、編碼蛋白及其克隆方法和重組刺參ITGB基因工程菌構建方法，特點是刺參ITGB基因序列如SEQIDNO.1所示；其克隆方法為根據與ITGB基因同源的表達序列標簽EST序列設計RACE的巢式引物，采用RACE技術擴增基因全長；刺參ITGB蛋白序列如SEQIDNO.2所示，用分別含有BamH I位點和Not I位點的引物擴增刺參ITGB蛋白；將克隆得到的目的基因插入載體獲得重組質粒，對重組質粒進行誘導表達，再進行純化復性即獲得基因工程菌，優點是對內毒素脂多糖具有較強的結合能力，對肽聚糖、甘露聚糖具有較弱的結合作用。

技術領域

本發明屬于分子生物學以及基因工程領域，尤其是涉及一種刺參ITGB基因、編碼蛋白及其克隆方法和重組刺參ITGB基因工程菌構建方法。

背景技術

β-整合素（β-Integrin，ITGB）為親異性細胞粘附分子，主要介導細胞與細胞間的相互作用及細胞與細胞外基質間的相互作用。幾乎存在于動植物細胞中。功能研究揭示脊椎動物的整合素發揮著維持機體完整性的功能，并在細胞識別、信號傳導和傳遞，細胞增殖、分化、成熟、運動、游走的調控，以及炎癥、創傷修復、腫瘤轉移等生理和病理過程中發揮重要作用。目前，對無脊椎動物整合素（Integrin）的研究主要集中在Integrin在機體早期發育過程的作用，有關無脊椎動物Integrin參與機體免疫的研究較少。已有的相關研究主要多集中在Integrin的β-亞基（ITGB）參與的免疫防御反應。Integrin對無脊椎動物的細菌性疾病有關，Integrin可能通過與細菌上帶有RGD結構域的配體結合，實現機體免疫細胞對細菌的吞噬和包囊作用，這在某種海洋無脊椎動物中已經被驗證。例如虐蚊的Integrin具有吞噬大腸桿菌的功能(Ying et al., 2012), 此外，在牡蠣Integrin的研究中，病原相關分子模式（PAMPs）結合分析表明Integrin重組蛋白對脂多糖（LPS）有一定的結合活性，對肽聚糖（PGN）、甘露聚糖（Mannan）結合活性卻明顯偏低。通過與之前牡蠣的PAMPs結合實驗對比，我們發現在相同濃度Integrin與3種內毒素孵育的條件下，刺參整合素（AjITGB）對LPS的結合活性是牡蠣結合活性的2倍，顯示了更強的LPS結合活性，而刺參整合素對PGN，Mannan的結合活性也很低，表明了其也有對內毒素結合上的特異性。刺參整合素在PAMPs結合上的優越性，在刺參病害的防治中更能發揮重要的作用。

刺參（Apostichopus japanicus），是屬于棘皮動物門（Echinodermata）、海參綱（Holothuridea）、循手目（Aspidochirota）的重要經濟種類，是一種高蛋白、低脂肪、低糖、無膽固醇的重要經濟養殖水產動物。但由病原菌引發的疾病嚴重制約了該產業的健康持續發展。目前對刺參病害的解決辦法主要是發病以后的救治，而無法做到病前的預防和發現，此類做法的結果往往會對刺參養殖業造成很大的損失，因此，篩選特異性好, 結合活性強的革蘭氏陰性菌結合分子是在必行,同時，通過構建水產動物整合素基因表達工程菌，從而產生工業化、高產量的刺參整合素，通過向患病刺參的生活環境中添加目的蛋白，在刺參自身產生整合素的基礎上增加了整合素對陰性致病菌的結合能力，從而提升刺參機體的免疫力，可以為刺參的發病提供一種解決手段。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種刺參ITGB基因、編碼蛋白及其克隆方法和重組刺參ITGB基因工程菌構建方法，表達的重組刺參β-整合素蛋白對脂多糖具有更強的結合活性，對肽聚糖、甘露聚糖結合活性較低。

本發明解決上述技術問題所采用的技術方案為：

1、一種刺參ITGB基因，該基因具有SEQIDNO.1所示的cDNA序列。

2、上述刺參ITGB基因的克隆方法，根據與ITGB基因同源的表達序列標簽EST序列設計基因特異性引物，采用RACE技術擴增基因全長，具體的步驟如下：