[發明專利]刺參ITGB基因、編碼蛋白及其克隆方法和重組刺參ITGB基因工程菌構建方法

有效

• 申請號: 201610118991.2
• 申請日: 2016-03-02
• 公開（公告）號: CN105713907B
• 公開（公告）日: 2019-05-28
• 發明（設計）人: 李成華;王振輝;張衛衛;邵銥娜;李曄;呂志猛
• 申請（專利權）人: 寧波大學
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C12N15/10;C07K14/705;C12N15/70
• 代理公司: 寧波奧圣專利代理事務所(普通合伙) 33226
• 代理人: 何仲

1.一種刺參ITGB基因，其特征在于該基因為SEQIDNO.1所示的cDNA序列。

2.一種權利要求1所述的刺參ITGB基因的克隆方法，其特征在于：根據與ITGB基因同源的表達序列標簽EST序列設計基因特異性引物，采用RACE技術擴增基因全長，具體的步驟如下：

(1)通過對燦爛弧菌誘導刺參血細胞cDNA文庫的表達序列標簽分析，發現了多條編碼ITGB基因的表達序列標簽序列，選取編碼刺參ITGB部分片段的表達序列標簽克隆；

(2)RACE引物設計：根據編碼刺參ITGB部分片段的表達序列標簽克隆設計RACE的巢式引物：3’上游特異性引物1：GGTTCATTGTCAAATCGGAG，3’上游特異性引物2：GATTACGTCGCTCTGGTCCA，5’下游特異性引物1：CCAACAATTCTGCAACCTCCG，

5’下游特異性引物2：TGCAACAAGGGGCACTTGGAG,擴增3’接頭引物Adaptor3：TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT，擴增5’接頭引物Adaptor5：CATGGCTACATGCTGACAGCCTA；

(3)RACE擴增獲取ITGB基因全長序列，具體步驟如下：

a.總RNA提取：取刺參體腔液制備得到RNA提取液；

b.3’-RACE擴增：將RNA提取液用3’-Full RACE Core Set with PrimeScript^TMRTase試劑盒逆轉錄合成擴增3’的模板，以此為模板，使用3’上游特異性引物1和擴增3’接頭引物進行PCR擴增，取PCR稀釋后的產物1ul作為模板，再用3’上游特異性引物2和擴增3’接頭引物進行PCR擴增得到3’端目的條帶；

c.5’-RACE擴增：將上述RNA提取液用5’-Full RACE Kit試劑盒逆轉錄合成擴增5’的模板，具體合成方法依試劑盒說明書操作，以此為模板，使用5’下游特異性引物1和Adaptor5進行PCR擴增，取PCR產物稀釋后1ul作為模板，再用5’下游特異性引物2和Adaptor5進行PCR得到5’端目的條帶；

d.將上述擴增產物的目的條帶用膠回收試劑盒回收，回收產物與載體pMD18-T連接，轉化至大腸桿菌Escherichia coli DH5α后，在含有氨芐濃度為50μg/mL的LB平板培養基中培養8-12h，挑取陽性克隆菌落，進行RCR驗證并送至上海生物工程有限公司測序，所得結果經DNAMAN軟件分析拼接得刺參ITGB基因全長序列，其基因序列如SEQIDNO.1所示，其中LB平板培養基配方為胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 10g/L。

3.根據權利要求2所述的一種刺參ITGB基因的克隆方法，其特征在于RACE擴增反應體系：模板1.0μL，10×PCR緩沖液2.5μL，濃度25mM的MgCl₂ 2.0μL，濃度10mM的dNTP 2.0μL，濃度10μM的特異性引物1.0μL，濃度10μM的接頭引物1.0μL，濃度5U/μL的DNA聚合酶0.2μL，超純水：15.3μL；擴增條件：94℃3min、94℃30s、60℃30s、72℃1min，共35個循環，最后72℃延伸10min。

4.一種權利要求1所述的刺參ITGB基因的編碼蛋白，其特征在于：該編碼蛋白為SEQIDNO.2所示的氨基酸序列。