[發明專利]一種銅綠假單胞菌重組蛋白Vac33的純化方法

有效

• 申請號: 201610118225.6
• 申請日: 2016-03-02
• 公開（公告）號: CN105669844B
• 公開（公告）日: 2019-11-08
• 發明（設計）人: 敬海明;顧江;鄒全明;章金勇;孫紅武;付強;牟道華;張玉東;徐麗敏
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第三軍醫大學
• 主分類號: C07K14/21
• 分類號: C07K14/21;C07K1/22;C07K1/16
• 代理公司: 重慶志合專利事務所(普通合伙) 50210
• 代理人: 胡榮琿

本發明提供了一種銅綠假單胞菌重組蛋白Vac33的純化方法，所述方法包括：1)收集表達銅綠假單胞菌重組蛋白Vac33的菌體；2)將步驟1)收集的菌體破菌，并離心，收集上清；3)將步驟2)得到的上清通過GST親和層析進行初純化；4)將步驟3)處理后的重組蛋白Vac33進行Q HP層析純化；5)將步驟4)純化后的重組蛋白Vac33進行G25層析柱純化；6)將步驟5)純化后的重組蛋白Vac33進行Q HP層析純化。本發明的純化方法工藝簡單，所獲得目標蛋白純度高，容易放大、重復性好，回收率較好。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種銅綠假單胞菌重組蛋白Vac33 (PcrV-OprI)的純化方法。

背景技術

銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa，PA)俗稱綠膿桿菌，廣泛分布于自然界、正常人皮膚、腸道、呼吸道中，感染可發生在人體任何部位和組織，常見于燒傷或創傷部位、中耳、角膜、尿道和呼吸道，可引起心內膜炎、胃腸炎、膿胸甚至敗血癥，該菌目前已成為ICU病房、燒傷、戰創傷等感染率最高的病原菌之一，全身感染死亡率在20％以上。

目前在PA疫苗方面已開展了廣泛研究，但普遍存在抗原類型單一、免疫保護效果低下等問題，尚無一種疫苗進入臨床應用。PcrV是銅綠假單胞菌III 型分泌系統的重要組件之一，它能夠形成同源多聚體，組裝成分泌系統運輸毒力因子和效應蛋白的“管道”，是銅綠假單胞菌III型分泌系統的關鍵組件 (Teiji S.等，Critical Care 2014)，鑒于PcrV在銅綠假單胞菌致病中的重要作用，該蛋白已成為銅綠假單胞菌感染治療性抗體針對的重要靶標。OprI蛋白為銅綠假單胞菌的外膜脂蛋白(outer membrane lipoprotein)，其位于銅綠假單胞菌的外膜，在細菌的生理和病理過程中發揮重要的作用。發明人構建了一種既能很好去除PA這些蛋白對細胞的毒性，又能保持這些蛋白抗原性的重組雙亞單位基因工程重組蛋白Vac33。目前，尚未見針對該重組雙亞單位基因工程蛋白Vac33疫苗純化方法的報道。

發明內容

本發明的目的是提供一種銅綠假單胞菌(PA)重組雙亞單位基因工程蛋白 Vac33疫苗的純化方法。

為實現上述目的，本發明提供如下的技術方案：

一種銅綠假單胞菌重組蛋白Vac33的純化方法，所述方法包括：

1)收集表達銅綠假單胞菌重組蛋白Vac33的菌體；

2)將步驟1)收集的菌體破菌，并離心，收集上清；

3)將步驟2)得到的上清通過GST親和層析進行初純化；其中，在所述親和層析中A液洗脫使用Prescission Protease酶進行酶切；

4)將步驟3)處理后的重組蛋白Vac33進行Q HP層析純化；其中，使用A 液平衡層析系統及Q HP層析柱，使用B液線性梯度洗脫；

5)將步驟4)純化后的重組蛋白Vac33進行G25層析純化；其中，采用C 液平衡G25層析系統及層析柱，分離純化重組蛋白，置換緩沖液；

6)將步驟5)純化后的重組蛋白Vac33進行Q HP層析純化，加入0.1％Triton X-100混勻，采用D液平衡層析系統及Q HP層析柱,去除痕量非目標蛋白，內毒素等雜質；

其中，A液為pH7.0-7.5的20mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄緩沖液，B液為 pH7.0-7.5的含1MNaCl的20mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄緩沖液；C液為pH6.0的含 10mM L-組氨酸，0.9％NaCl的溶液；D液為pH6.0的10mM L-組氨酸，0.9％NaCl， 0.1％Triton X-100溶液。