[發明專利]一種銅綠假單胞菌重組蛋白Vac33的純化方法

有效

• 申請號: 201610118225.6
• 申請日: 2016-03-02
• 公開（公告）號: CN105669844B
• 公開（公告）日: 2019-11-08
• 發明（設計）人: 敬海明;顧江;鄒全明;章金勇;孫紅武;付強;牟道華;張玉東;徐麗敏
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第三軍醫大學
• 主分類號: C07K14/21
• 分類號: C07K14/21;C07K1/22;C07K1/16
• 代理公司: 重慶志合專利事務所(普通合伙) 50210
• 代理人: 胡榮琿

1.一種銅綠假單胞菌重組蛋白Vac33的純化方法，其特征在于，該蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述方法包括：

1)收集表達銅綠假單胞菌重組蛋白Vac33的菌體；

2)將步驟1)收集的菌體破菌，并離心，收集上清；

3)將步驟2)得到的上清通過GST親和層析進行初純化；其中，在所述親和層析中A液進行洗脫，使用Prescission Protease酶進行酶切；

4)將步驟3)處理后的重組蛋白Vac33進行Q HP層析純化；其中，使用A液平衡層析系統及Q HP層析柱，使用B液線性梯度洗脫；

5)將步驟4)純化后的重組蛋白Vac33進行G25層析柱純化；其中，采用C液平衡G25層析系統及層析柱，分離純化重組蛋白，置換緩沖液；

6)將步驟5)純化后的重組蛋白Vac33進行Q HP層析純化，加入0.1％Triton X-100混勻，采用D液平衡層析系統及Q HP層析柱,去除雜質；

其中，A液為pH7.0-7.5的20mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄緩沖液，B液為pH7.0-7.5的含1M NaCl的20mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄緩沖液；C液為pH6.0的含10mM L-組氨酸，0.9％NaCl的溶液；D液為pH6.0的10mM L-組氨酸，0.9％NaCl，0.1％Triton X-100溶液。

2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟2)是通過包括下述步驟的方法實現的：

將收集表達重組蛋白Vac33的大腸桿菌菌體以pH7.0-7.5的10mM的PBS緩沖液混勻懸浮，預冷后采用高壓勻漿破菌，4℃，以10,000～15,000g的轉速高速離心，收集上清。

3.如權利要求1或2所述的方法，其特征在于，步驟2)中以60～80MPa的高壓破菌。

4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟3)中所述的GST親和層析的層析柱的填料選自Glutathione Sepharose4B、Glutathione Sepharose4FF或Glutathione SepharoseHP中的一種。

5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟3)中所述Prescission Protease酶帶有GST標簽。

6.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟4)所述的Q HP層析柱的填料選自QSepharose HP、QSepharose FF或CaptoQ中的一種。

7.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟4)中洗脫流速為15ml/min，洗脫梯度為B液從0到100％。

8.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟5)所述的G25層析柱的填料選自Sephadex G-25 Coarse或Sephadex G-25 Medium、Sephadex G-25 Fine或Sephadex G-25Superfine中的一種。

9.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟6)所述的Q HP層析柱的填料選自QSepharose HP、Q Sepharose FF或Capto Q中的一種。