[發明專利]銅綠假單胞菌疫苗重組蛋白Vac9的純化方法

在審

• 申請號: 201610118109.4
• 申請日: 2016-03-02
• 公開（公告）號: CN105622733A
• 公開（公告）日: 2016-06-01
• 發明（設計）人: 敬海明;顧江;鄒全明;章金勇;孫紅武;付強;牟道華;張玉東;徐麗敏
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第三軍醫大學
• 主分類號: C07K14/21
• 分類號: C07K14/21;C12N15/31;C07K1/22;C07K1/16
• 代理公司: 重慶志合專利事務所 50210
• 代理人: 胡榮琿

技術領域

本發明屬于生物制藥領域，具體涉及銅綠假單胞菌(PA)疫苗重組蛋白Vac9 (OprL)的純化方法。

背景技術

銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa，PA)俗稱綠膿桿菌，為非發酵 菌中的假單胞菌屬，廣泛分布于自然界、正常人皮膚、腸道、呼吸道中，在醫 院病房及醫療器械中也普遍存在，是臨床上最為常見的條件致病菌之一。由于 PA在臨床上的高感染率和耐藥率的不斷攀升，尋找新的“非抗生素療法”迫在 眉睫，從免疫學角度入手，研制開發出安全有效的疫苗成為最為理想的選擇。

OprL為銅綠假單胞菌的肽聚糖相關蛋白(peptidoglycanassociated lipoprotein)，其位于銅綠假單胞菌的外膜，在細菌的生理和病理過程中發揮 重要的作用。OprL蛋白在銅綠假單胞菌中高度保守，已經有研究將其作為銅綠 假單胞菌的診斷靶點(Xu，J.等.Clin.Microbiol.Antimicrob.2004)。同 時有研究發現在病人的血清中發現有抗OprL的抗體的存在(Montor，W.R等， InfectImmun2009)，此外OprL還能誘導小鼠產生保護性Th17免疫應答反應 (Wu，W等，AmJRespirCritCareMed2012)。鑒于這些因素，OprL可以作 為良好的基因工程疫苗候選抗原。

申請人采用基因工程技術克隆通過大腸桿菌基因工程菌表達獲得銅綠假單 胞菌(PA)疫苗重組蛋白Vac9(OprL)，所述重組蛋白經動物試驗證明，可有效 刺激機體產生較高的體液免疫應答和良好的免疫保護作用，有利于銅綠假單胞 菌的預防、診和治療。目前，尚未見針對該重組蛋白Vac9的純化方法的報道。

發明內容

本發明的目的是提供一種銅綠假單胞菌(PA)重組亞單位基因工程蛋白Vac9 的純化方法。該方法工藝簡單，所獲得目標蛋白純度高，容易放大、重復性好， 回收率較好。

本發明的技術方案是：

一種銅綠假單胞菌亞單位重組基因工程疫苗抗原Vac9，其核酸序列如SEQID NO：1所示，氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。

銅綠假單胞菌亞單位重組基因工程疫苗抗原Vac9的純化方法，包括以下步 驟：

1)收集構建表達基因工程蛋白Vac9的大腸桿菌工程菌高密度發酵的菌體；

2)將步驟1)收集的菌體破菌，離心，收集上清；

3)將步驟2)得到的上清液通過GST親和層析進行親和純化；其中，在所 述親和層析中緩沖液洗脫使用PrescissionProtease酶進行酶切；

4)步驟3)處理后的重組蛋白Vac9用A液進行樣品處理；

5)步驟4)處理后的重組蛋白Vac9進行PhenylHP層析柱純化，其中，使 用B液平衡層析系統及PhenylHP層析柱，用C液線性梯度洗脫；

6)將步驟5)純化后的重組蛋白Vac9進行G25層析柱純化；其中，采用D 液平衡G25層析系統及層析柱，分離純化重組蛋白，置換緩沖液；

7)將步驟6)純化后的重組蛋白Vac9進行QHP去內毒素，其中，在D緩 沖液平衡層析系統及QHP層析柱內去除內毒素，分離純化重組蛋白Vac9；

其中，A液為pH7.5的含20mMPB，3M(NH₄)₂SO₄的緩沖液，B液為pH7.5 的含20mMPB，2M(NH₄)₂SO₄緩沖液；C液為的pH7.520mMPB溶液；D液為pH6.0 的含10mML-組氨酸，0.9％NaCl，0.1％Trtionx-100緩沖溶液。

步驟2)的具體方法是將培養的細菌以PBS(10-20mM，pH7.0-7.5)緩沖液懸 浮，預冷后采用高壓均質破菌，在4℃條件下，10,000-15,000g高速離心 15-30min，收集上清，所述的高壓均質破菌壓力為60-80MPa，；