[發(fā)明專利]銅綠假單胞菌疫苗重組蛋白Vac9的純化方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201610118109.4
• 申請日: 2016-03-02
• 公開（公告）號: CN105622733A
• 公開（公告）日: 2016-06-01
• 發(fā)明（設計）人: 敬海明;顧江;鄒全明;章金勇;孫紅武;付強;牟道華;張玉東;徐麗敏
• 申請（專利權(quán)）人: 中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學
• 主分類號: C07K14/21
• 分類號: C07K14/21;C12N15/31;C07K1/22;C07K1/16
• 代理公司: 重慶志合專利事務所 50210
• 代理人: 胡榮琿

1.一種銅綠假單胞菌亞單位重組基因工程疫苗抗原Vac9，其特征在于，該 抗原的核酸序列如SEQIDNO：1所示，氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。

2.權(quán)利要求1所述抗原的純化方法，其特征在于，所述方法包括：

1)收集表達銅綠假單胞菌重組蛋白Vac9的菌體；

2)將步驟1)收集的菌體破菌，離心，收集上清；

3)將步驟2)得到的上清液通過GST親和層析進行親和純化；其中，在所 述親和層析中緩沖液洗脫使用PrescissionProtease酶進行酶切；

4)步驟3)處理后的重組蛋白Vac9用A液進行樣品處理；

5)步驟4)處理后的重組蛋白Vac9進行PhenylHP層析柱純化，其中，使 用B液平衡層析系統(tǒng)及PhenylHP層析柱，用C液線性梯度洗脫；

6)將步驟5)純化后的重組蛋白Vac9進行G25層析柱純化；其中，采用D 液平衡G25層析系統(tǒng)及層析柱，分離純化重組蛋白，置換緩沖液；

7)將步驟6)純化后的重組蛋白Vac9進行QHP去內(nèi)毒素，其中，在D緩 沖液平衡層析系統(tǒng)及QHP層析柱內(nèi)去除內(nèi)毒素，分離純化重組蛋白Vac9；

其中，A液為pH7.5的含20mMPB，3M(NH₄)₂SO₄的緩沖液，B液為pH7.5 的含20mMPB，2M(NH₄)₂SO₄緩沖液；C液為的pH7.520mMPB溶液；D液為pH6.0 的含10mML-組氨酸，0.9％NaCl，0.1％Trtionx-100緩沖溶液。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述純化方法，其特征在于：步驟2)的具體方法是將 培養(yǎng)的細菌以PBS(10-20mM，pH7.0-7.5)緩沖液懸浮，預冷后采用高壓均質(zhì)破菌， 在4℃條件下，10,000-15,000g高速離心15-30min，收集上清，所述的高壓均 質(zhì)破菌壓力為60-80MPa。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述純化方法，其特征在于：步驟3)所述GST親和純 化方法是：先用GST親和填料進行初步結(jié)合，接著用10-20mMNa₂HPO₄-NaH₂PO₄， 1MNaClpH7.0-7.5緩沖液清洗，再用PP酶進行酶切，最后用10-20mMNa₂HPO₄-NaH₂PO₄，pH7.0-7.5緩沖液對目標蛋白進行洗脫；所述GST親和層析使用的填 料為GST-瓊脂糖凝膠4B或GST-瓊脂糖凝膠4FF或GST-瓊脂糖凝膠HP。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述純化方法，其特征在于：步驟4)所述的樣品處理 是：步驟3)所得重組蛋白Vac9與A液按體積比1∶2進行混合，A液滴加到重 組蛋白Vac9溶液，邊滴邊攪拌。

PP酶會針對目的蛋白與GST標簽間的酶切位點發(fā)生作用，而自身與GST標 簽結(jié)合，從而達到酶切分離目的蛋白的效果。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述純化方法，其特征在于：步驟5)所述的PhenylHP 層析純化是：用B液平衡層析系統(tǒng)及PhenylHP層析柱，上樣步驟4)處理后的 樣品，上樣后用B液沖洗未結(jié)合蛋白，直至基線平穩(wěn)，再用C液線性梯度洗脫； 其中，PhenylHP層析柱的填料為PhenylSepharoseHP或PhenylSepharose6FF 或CaptoPhenylImpRes。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述純化方法，其特征在于：步驟6)所述的G25層析 是：用D液平衡層析系統(tǒng)及G25層析柱，將步驟5)純化獲得的樣品，上樣， 分離純化重組蛋白Vac9，置換緩沖液；其中G25層析柱的填料為SephadexG-25 Coarse或SephadexG-25Medium或SephadexG-25Fine或SephadexG-25 Superfine。