[發(fā)明專(zhuān)利]銅綠假單胞菌疫苗重組蛋白Vac11的純化方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610117826.5
• 申請(qǐng)日: 2016-03-02
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN105647894A
• 公開(kāi)（公告）日: 2016-06-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 敬海明;顧江;鄒全明;章金勇;孫紅武;付強(qiáng);牟道華;張玉東;徐麗敏
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12N9/52
• 分類(lèi)號(hào): C12N9/52;C07K1/22;C07K1/16;A61K39/104;A61P31/04;C12R1/385
• 代理公司: 重慶志合專(zhuān)利事務(wù)所 50210
• 代理人: 胡榮琿

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物制藥領(lǐng)域，具體涉及銅綠假單胞菌(PA)重組蛋白Vac11 (AmpDh3)的分離純化方法。

背景技術(shù)

銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa，PA)俗稱(chēng)綠膿桿菌，廣泛分布于 自然界、正常人皮膚、腸道、呼吸道中，感染可發(fā)生在人體任何部位和組織， 該菌目前已成為ICU病房、燒傷、戰(zhàn)創(chuàng)傷等感染率最高的病原菌之一，全身感 染死亡率在20％以上。

目前在PA疫苗方面已開(kāi)展了廣泛研究，但普遍存在抗原類(lèi)型單一、免疫保 護(hù)效果低下等問(wèn)題，尚無(wú)一種疫苗進(jìn)入臨床應(yīng)用。AmpDh3是銅綠假單胞菌的典 型鋅蛋白酶，其位于細(xì)菌的周漿間隙，在細(xì)菌細(xì)胞壁的形成和重構(gòu) (re-modeling)過(guò)程中發(fā)揮重要作用(LeeM等，JAmChemSoc.2013)。此 外，AmpDh3基因的缺失會(huì)導(dǎo)致銅綠假單胞菌細(xì)菌的毒力明顯下降(MoyaB,等 AntimicrobAgentsChemother.2008)。鑒于A(yíng)mpDh3在銅綠假單胞菌生理和致 病過(guò)程中的重要作用，其可以作為重組基因工程亞單位疫苗的重要候選抗原。

申請(qǐng)人采用基因工程技術(shù)克隆通過(guò)大腸桿菌基因工程菌表達(dá)獲得銅綠假單 胞菌(PA)疫苗重組蛋白Vac11(AmpDh3)，所述重組蛋白經(jīng)動(dòng)物試驗(yàn)證明，可 有效刺激機(jī)體產(chǎn)生較高的體液免疫應(yīng)答和良好的免疫保護(hù)作用，有利于銅綠假 單胞菌的預(yù)防、診和治療。目前，尚未見(jiàn)針對(duì)該重組蛋白Vac11的純化方法的 報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的：提供一種銅綠假單胞菌(PA)重組亞單位基因工程蛋白Vac11 疫苗的純化方法。該方法工藝簡(jiǎn)單，所獲得目標(biāo)蛋白純度高，容易放大、重復(fù) 性好，回收率較好。

本發(fā)明的技術(shù)方案是：

銅綠假單胞菌亞單位重組基因工程疫苗候選抗原Vac11，其核酸序列如SEQ IDNO：1所示、氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。

銅綠假單胞菌亞單位重組基因工程疫苗候選抗原Vac11的純化方法。包括 步驟：收集制備的所述抗原Vac11；按照高壓破菌、離心；GST親和純化；QHP 層析純化；QHP層析純化；G25層析純化；QHP層析純化的順序組合對(duì)制備的 抗原進(jìn)行純化。

上述純化方法的具體步驟如下：

1)高壓破菌

收集的菌體用pH為7.0-7.5的10mMPB緩沖液混勻懸浮，預(yù)冷后采用高壓 勻漿破菌，高速離心，收集上清；

2)GST親和純化

GST親和層析填料進(jìn)行初步純化，使用A液對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行純化， PrescissionProtease酶進(jìn)行酶切洗脫：

3)QHP層析純化

將經(jīng)步驟2)純化的目標(biāo)蛋白，使用A平衡層析系統(tǒng)及QHP層析柱，B液 線(xiàn)性梯度洗脫；

4)G25層析純化

將經(jīng)步驟3)純化的目標(biāo)蛋白，使用G25層析柱純化，采用C液平衡層析 系統(tǒng)及層析柱，分離純化目標(biāo)蛋白，置換緩沖液；

5)QHP層析純化

將經(jīng)步驟4)純化的目標(biāo)蛋白，加入0.1％TritonX-100混勻，采用D液平 衡層析系統(tǒng)及QHP層析柱，去除痕量非目標(biāo)蛋白，內(nèi)毒素等雜質(zhì)，分離純化目 標(biāo)蛋白；

其中，A液為pH7.0-7.5的20mMNa₂HPO₄-NaH₂PO₄的緩沖溶液，B液為 pH7.0-7.5的20mMNa₂HPO₄-NaH₂PO₄，1MNaCl，C液為pH6.0的10mMHis，0.25M NaCl，D液為pH6.0的10mMHis，0.25MNaCl，0.1％TritonX-100。

步驟1)所述的高壓勻漿破菌采用60-80MPa，高速離心獲取破菌上清。

步驟2)所述的GST親和層析使用的填料為GlutathioneSepharose4B或 GlutathioneSepharose4FF或GlutathioneSepharoseHP。

步驟2)所述的PrescissionProtease酶帶有GST標(biāo)簽。

步驟3)所述的QHP層析柱的填料為QSepharoseHP或QSepharoseFF 或CaptoQ。