[發(fā)明專利]銅綠假單胞菌疫苗重組蛋白Vac11的純化方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610117826.5
• 申請(qǐng)日: 2016-03-02
• 公開（公告）號(hào): CN105647894A
• 公開（公告）日: 2016-06-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 敬海明;顧江;鄒全明;章金勇;孫紅武;付強(qiáng);牟道華;張玉東;徐麗敏
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N9/52
• 分類號(hào): C12N9/52;C07K1/22;C07K1/16;A61K39/104;A61P31/04;C12R1/385
• 代理公司: 重慶志合專利事務(wù)所 50210
• 代理人: 胡榮琿

1.一種銅綠假單胞菌亞單位重組基因工程疫苗候選抗原Vac11，其特征在 于：該抗原的核酸序列如SEQIDNO：1所示、氨基酸序列如SEQIDNO：2所 示。

2.一種權(quán)利要求1所述抗原的純化方法。其特征在于，包括步驟：收集制 備的所述抗原Vac11；按照高壓破菌、離心；GST親和純化；QHP層析純化；G25 層析純化；QHP層析純化的順序組合對(duì)制備的抗原進(jìn)行純化。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的純化方法，其特征在于：

1)高壓破菌

收集的菌體作為目標(biāo)蛋白，用pH為7.0-7.5的10mMPB緩沖液混勻懸浮， 預(yù)冷后采用高壓勻漿破菌，高速離心，收集上清；

2)GST親和純化

GST親和層析填料進(jìn)行初步純化，使用A液對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行純化， PrescissionProtease酶進(jìn)行酶切洗脫：

3)QHP層析純化

將經(jīng)步驟2)純化的目標(biāo)蛋白，使用A平衡層析系統(tǒng)及QHP層析柱，B液 線性梯度洗脫；

4)G25層析純化

將經(jīng)步驟3)純化的目標(biāo)蛋白，使用G25層析柱純化，采用C液平衡層析 系統(tǒng)及層析柱，分離純化目標(biāo)蛋白，置換緩沖液；

5)QHP層析純化

將經(jīng)步驟4)純化的目標(biāo)蛋白，加入0.1％TritonX-100混勻，采用D液平 衡層析系統(tǒng)及QHP層析柱，去除雜質(zhì)，分離純化目標(biāo)蛋白；

其中，A液為pH7.0-7.5的20mMNa₂HPO₄-NaH₂PO₄的緩沖溶液，B液為 pH7.0-7.5的20mMNa₂HPO₄-NaH₂PO₄，1MNaCl，C液為pH6.0的10mMHis，0.25M NaCl，D液為pH6.0的10mMHis，0.25MNaCl，0.1％TritonX-100。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述純化方法，其特征在于：步驟1)所述的高壓勻漿 破菌采用60-80MPa，高速離心獲取破菌上清。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述純化方法，其特征在于：步驟2)所述的GST親和 層析使用的填料為GlutathioneSepharose4B或GlutathioneSepharose4FF 或GlutathioneSepharoseHP。

6.根據(jù)權(quán)利要求3所述純化方法，其特征在于：步驟2)所述的Prescission Protease酶帶有GST標(biāo)簽。

7.根據(jù)權(quán)利要求3所述純化方法，其特征在于：步驟3)所述的QHP層析 柱的填料為QSepharoseHP或QSepharoseFF或CaptoQ。

8.根據(jù)權(quán)利要求3所述純化方法，其特征在于：步驟4)所述的G25層析 柱為SephadexG-25Coarse或SephadexG-25Medium或SephadexG-25Fine 或SephadexG-25Superfine。

9.根據(jù)權(quán)利要求3所述純化方法，其特征在于：步驟5)所述的QHP層析 柱為QSepharoseHP或QSepharoseFF或CaptoQ。

10.根據(jù)權(quán)利要求2-9任一項(xiàng)所述的純化方法，其特征在于，所述抗原Vac11 采用以下方法制備：

1)設(shè)計(jì)正向引物和反向引物通過PCR擴(kuò)增或全基因合成獲得銅綠假單胞菌 亞單位重組基因工程疫苗候原Vac11蛋白片段的核苷酸序列；

2)將步驟1)獲得的核苷酸序列克隆表達(dá)至表達(dá)載體構(gòu)建重組載體，然后 將該重組載體轉(zhuǎn)化至宿主菌；

3)誘導(dǎo)轉(zhuǎn)換后的宿主菌表達(dá)重組蛋白。