[發(fā)明專利]銅綠假單胞菌重組蛋白OprL及制備方法和應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610117803.4
• 申請(qǐng)日: 2016-03-02
• 公開（公告）號(hào): CN105732778A
• 公開（公告）日: 2016-07-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 章金勇;顧江;鄒全明;楊峰;楊茜;趙莉群;彭六生;吳翼;王逸麟
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)
• 主分類號(hào): C07K14/21
• 分類號(hào): C07K14/21;C12N15/31;C12N15/70;C12N1/21;A61K39/104;A61P31/04
• 代理公司: 重慶志合專利事務(wù)所 50210
• 代理人: 胡榮琿

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)制藥領(lǐng)域，具體涉及一種銅綠假單胞菌重組蛋白OprL，本發(fā)明進(jìn)一步涉及該重組蛋白的制備方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa，PA)俗稱綠膿桿菌，為非發(fā)酵菌中的假單胞菌屬，廣泛分布于自然界、正常人皮膚、腸道、呼吸道中，在醫(yī)院病房及醫(yī)療器械中也普遍存在，是臨床上最為常見的條件致病菌之一。目前在全球范圍內(nèi)，該菌已成為ICU病房、燒傷、戰(zhàn)創(chuàng)傷感染，機(jī)械通氣相關(guān)肺炎(VAP)分離率最高的病原菌之一。PA感染可發(fā)生在人體任何部位和組織，如燒傷或創(chuàng)傷部位、中耳、角膜、尿道和呼吸道等，也可引起心內(nèi)膜炎、胃腸炎、肺炎甚至敗血癥等全身感染，全身感染死亡率超過20％。

此外，由于抗生素的濫用等原因，PA的耐藥問題逐漸突出，出現(xiàn)了泛耐藥銅綠假單胞菌(PDR-PA)和多重耐藥銅綠假單胞菌(MDR-PA)，且耐藥性PA的分離率逐年上升。中國(guó)CHINET2005--2012年連續(xù)監(jiān)測(cè)資料顯示，PA對(duì)常用抗菌藥物的耐藥率保持在較高水平，但略呈下降趨勢(shì)。如亞胺培南的年度耐藥率分別為31.0％、42.8％、35.8％、30.5％、30.5％、30.8％、29.1％和29.1％，對(duì)美羅培南的年度耐藥率分別為32.0％、34.1％、28.5％、24.5％、25.2％、25.8％、25.0％和27.1％，但其中泛耐藥(PDR-PA)菌株數(shù)量顯著增多，在2011年和2012年分別達(dá)到1.8％和1.5％(銅綠假單胞菌下呼吸道感染診治專家共識(shí)，中華結(jié)核和呼吸雜志，2014年1月37卷1期)。由于PA在臨床上的高感染率和耐藥率的不斷攀升，尋找新的“非抗生素療法”迫在眉睫，從免疫學(xué)角度入手，研制開發(fā)出安全有效的疫苗成為最為理想的選擇。

基因工程亞單位疫苗通過基因工程的手段，將病原體的致病因子或其突變體的基因克隆至的蛋白表達(dá)載體，重組子在工程菌內(nèi)進(jìn)行大規(guī)模表達(dá)，經(jīng)過純化后制備成基因工程亞單位疫苗。該疫苗具有工藝簡(jiǎn)單、成本低、可操作性強(qiáng)等有點(diǎn)，已成為疫苗研發(fā)的重要方向。研發(fā)基因工程疫苗的關(guān)鍵是篩選到良好的保護(hù)性抗原分子。

OprL為銅綠假單胞菌的肽聚糖相關(guān)蛋白(peptidoglycanassociatedlipoprotein)，其位于銅綠假單胞菌的外膜，在細(xì)菌的生理和病理過程中發(fā)揮重要的作用。OprL蛋白在銅綠假單胞菌中高度保守，已經(jīng)有研究將其作為銅綠假單胞菌的診斷靶點(diǎn)(Xu，J.等.Clin.Microbiol.Antimicrob.2004)。同時(shí)有研究發(fā)現(xiàn)在病人的血清中發(fā)現(xiàn)有抗OprL的抗體的存在(Montor，W.R等，InfectImmun2009)，此外OprL還能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生保護(hù)性Th17免疫應(yīng)答反應(yīng)(Wu，W等，AmJRespirCritCareMed2012)。鑒于這些因素，OprL可以作為良好的基因工程疫苗候選抗原。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種銅綠假單胞菌重組蛋白OprL及制備方法和應(yīng)用，所述重組蛋白經(jīng)動(dòng)物試驗(yàn)證明，可有效刺激機(jī)體產(chǎn)生較高的體液免疫應(yīng)答和良好的免疫保護(hù)作用，有利于銅綠假單胞菌的預(yù)防、診斷和治療。采用本發(fā)明所示方法制備的重組蛋白，表達(dá)量高、便于分離純化。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下的技術(shù)方案：

銅綠假單胞菌重組蛋白OprL包含銅綠假單胞菌肽聚糖蛋白(PeptidoglycanAssociatedLipoprotein)片段，所述重組蛋白的核苷酸序列為SEQIDNO：1，氨基酸序列為SEQIDNO：2。

一種表達(dá)載體，包含編碼上述重組蛋白的核苷酸序列。所述表達(dá)載體由骨架質(zhì)粒可修飾地連接編碼上述重組蛋白的核苷酸序列形成；優(yōu)選地，所述骨架質(zhì)粒選自pGex系列載體、pET系列載體或pQE系列載體。

本發(fā)明優(yōu)選采用pGEX-6p-2載體來構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒，表達(dá)重組蛋白OprL，pGEX是由Smith和Johnson于1987年構(gòu)建的表達(dá)融合蛋白的載體，其主要特點(diǎn)是載體上接有一個(gè)分子量為26kDa的谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)，所表達(dá)的融合蛋白中就含有一個(gè)GST標(biāo)簽，此標(biāo)簽是蛋白純化的標(biāo)記。與其他融合載體相比，pGEX系列載體具有純化條件溫和、步驟簡(jiǎn)單、不需要變性劑的加入，從而使純化后的蛋白能最大限度保持其空間構(gòu)象和免疫原性。

包含上述表達(dá)載體的宿主菌。所述宿主菌選自大腸桿菌XL1-blue、BL21或HMS174菌株中的一種，優(yōu)選為大腸桿菌XL1-blue菌株。

上述重組蛋白的制備方法，包括以下步驟：