[發明專利]CLCA2蛋白在人宮頸癌siha細胞中表達的檢測方法及應用

在審

• 申請號: 201610117463.5
• 申請日: 2016-02-24
• 公開（公告）號: CN105648083A
• 公開（公告）日: 2016-06-08
• 發明（設計）人: 王芳
• 申請（專利權）人: 蘭州大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;G01N33/68;A61K38/17;A61P35/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及分子生物學和藥學應用技術領域，具體涉及CLCA2蛋白在人宮頸癌 siha細胞中表達的檢測方法及其應用。

背景技術

宮頸癌是全世界導致婦女死亡的最主要惡性腫瘤之一，據統計，我國每年約有5萬 人死于宮頸癌，且發病率呈逐年上升、年輕化的趨勢。1995年國際癌癥研究中心公布研究結 果HPV與宮頸癌有密切因果關系。HPV感染已成為嚴重危害人類健康的病原體。因此，研制高 效廉價的預防性HPV疫苗，對預防宮頸癌具有十分重要的意義。

人乳頭瘤病毒(HumanPapillomavirus，HPV)屬乳多空病毒科乳頭瘤病毒屬的一 個無包膜的小型雙鏈環狀DNA病毒，HPV是一種嗜上皮性病毒，具有高度的種屬特異性。HPV 基因組主要編碼2種晚期蛋白(L1和L2)和6種早期蛋白(E1、E2、E4、E5、E6和E7)。晚期蛋白為 HPV衣殼結構成分，參與病毒顆粒組裝。E6和E7是HPV的主要致癌蛋白，可使宿主細胞永生化 并進一步發生惡性轉化，HPV相關腫瘤中組成型持續表達E6和E7蛋白，E6和E7基因只存在于 癌變組織中，在正常組織中不存在。近年來研究發現，HPV16亞型感染是激發宮頸上皮惡性 轉化的最主要因素，HPV16導致宮頸癌的主要致病機理是HPV基因整合到宿主細胞DNA中，其 中HPV16E6的作用非常關鍵。因而，抑制HPVE6的表達，進而抑制其功能，有望成為宮頸癌預 防和治療的一個重要手段。

發明內容

本發明的目的是提供一種CLCA2蛋白在人宮頸癌siha細胞中表達的檢測方法，另 一目的是提供CLCA2蛋白在制備預防和治療宮頸癌的藥物組合物中的應用。

為了實現上述目的，本發明采用以下技術方案予以實現：

CLCA2蛋白在人宮頸癌siha細胞中表達的檢測方法，包括以下的具體步驟：

(1)利用基因芯片實驗檢測不同濃度的異喹啉類生物堿異紫堇堿對HPV16Siha細胞處理后差異基因表達譜的改變；以干燥禿瘡花為原料，利用乙醇提取法和硅膠柱色譜分離法進行異喹啉類生物堿的提取和異紫堇堿的分離，得到異紫堇堿，SiHa細胞株生長到對數生長期，密度達80％時用濃度為800μmol/L的異紫堇堿處理，將樣本分為四組，分別是：①未經異紫堇堿處理的SiHa細胞，②經異紫堇堿處理12小時后的SiHa細胞，③經異紫堇堿處理24小時后的SiHa細胞，④經異紫堇堿處理48小時后的SiHa細胞，分別以Trizol法裂解后收集樣品，采用HumanTranscriptomeArray2.0表達譜芯片篩選表達差異的mRNA；

(2)利用RT-PCR法檢測藥物干預前后細胞中基因表達水平，細胞中RNA病毒的含量 和直接克隆及特定基因的cDNA序列；以5000個/孔將細胞種進96孔板中，培養24h后，棄去舊 培養液，加入濃度為800μmol/L的異紫堇定堿干預，分別培養12h，24h，48h，用BioTeke的RNA 提取試劑盒抽提總RNA，首先，用槍頭吸盡培養基，向各孔中加入125μl*2的Buffer，再用槍 頭吸盡CellAmpTMWashingBuffer，后向各孔中加50μl的Processing溶液，反復吹打 Processing液后，移至微量離心管中，75℃水浴5min，分裝得到的細胞裂解液，以便后續反 轉錄實驗，同時每組均設定復孔；5μgRNA被反轉錄成cDNA10μl體系，其反轉錄體系包括：5 ×PrimeScriptTMBuffer2μl，PrimeScriptTMRTEnzymeMixI0.5μl，50μMOligodT Primer0.5μl，Random6mers0.5μl，RNaseFreedH2O4.5μl，cDNA2μl，反轉錄條件37℃、 15min，85℃、5秒，再以cDNA為模板進行特異性擴增，其擴增反應20μl體系由：Tap酶10μl， Forwardprimer0.4μl，Reverseprimer0.4μl，Rox0.4μl，ddH₂O6.8μl，and2μlcDNA模 板組成，需要擴增目的基因的引物序列和退火溫度由Table1給出，β-actin被擴增作為對 照，熒光實時PCR反應結束后，由系統分析軟件確定閾值，進而確定各反應樣本的CT值，采用 相對定量的2-ΔΔCT法分析PCR結果，確定各樣本之間基因的表達差異；

公式：ΔCT＝(CTTarget-CTActin)