[發明專利]CLCA2蛋白在人宮頸癌siha細胞中表達的檢測方法及應用

在審

• 申請號: 201610117463.5
• 申請日: 2016-02-24
• 公開（公告）號: CN105648083A
• 公開（公告）日: 2016-06-08
• 發明（設計）人: 王芳
• 申請（專利權）人: 蘭州大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;G01N33/68;A61K38/17;A61P35/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.CLCA2蛋白在人宮頸癌siha細胞中表達的檢測方法，其特征在于，包括以下的具體步 驟：

(1)利用基因芯片實驗檢測不同濃度的異喹啉類生物堿異紫堇堿對HPV16Siha細胞處 理后差異基因表達譜的改變；以干燥禿瘡花為原料，利用乙醇提取法和硅膠柱色譜分離法 進行異喹啉類生物堿的提取和異紫堇堿的分離，得到異紫堇堿，SiHa細胞株生長到對數生 長期，密度達80％時用濃度為800μmol/L的異紫堇堿處理，將樣本分為四組，分別是：①未經 異紫堇堿處理的SiHa細胞，②經異紫堇堿處理12小時后的SiHa細胞，③經異紫堇堿處理24 小時后的SiHa細胞，④經異紫堇堿處理48小時后的SiHa細胞，分別以Trizol法裂解后收集 樣品，采用HumanTranscriptomeArray2.0表達譜芯片篩選表達差異的 mRNA；

(2)利用RT-PCR法檢測藥物干預前后細胞中基因表達水平，細胞中RNA病毒的含量和直 接克隆及特定基因的cDNA序列；以5000個/孔將細胞種進96孔板中，培養24h后，棄去舊培養 液，加入濃度為800μmol/L的異紫堇定堿干預，分別培養12h，24h，48h，用BioTeke的RNA提取 試劑盒抽提總RNA，首先，用槍頭吸盡培養基，向各孔中加入125μl*2的Buffer，再用槍頭吸 盡CellAmpTMWashingBuffer，后向各孔中加50μl的Processing溶液，反復吹打 Processing液后，移至微量離心管中，75℃水浴5min，分裝得到的細胞裂解液，以便后續反 轉錄實驗，同時每組均設定復孔；5μgRNA被反轉錄成cDNA10μl體系，其反轉錄體系包括：5 ×PrimeScriptTMBuffer2μl，PrimeScriptTMRTEnzymeMixI0.5μl，50μMOligodT Primer0.5μl，Random6mers0.5μl，RNaseFreedH2O4.5μl，cDNA2μl，反轉錄條件37 ℃、15min，85℃、5秒，再以cDNA為模板進行特異性擴增，其擴增反應20μl體系由：Tap酶10μ l，Forwardprimer0.4μl，Reverseprimer0.4μl，Rox0.4μl，ddH₂O6.8μl，and2μlcDNA 模板組成，需要擴增目的基因的引物序列和退火溫度由Tablel給出，β-actin被擴增作為對 照，熒光實時PCR反應結束后，由系統分析軟件確定閾值，進而確定各反應樣本的CT值，采用 相對定量的2-ΔΔCT法分析PCR結果，確定各樣本之間基因的表達差異；

公式：ΔCT＝(CTTarget-CTActin)

ΔΔCT＝(CTTarget-CTActin)Timex-(CTTarget-CTActin)TimeO

2-ΔΔCT表示的是實驗組目的基因的表達相對于對照組的變化倍數。

表1引物及擴增產物的大小

(3)通過WesternBlot法觀察HPV病毒致瘤基因E6蛋白表達的變化；細胞總蛋白以RIPA 裂解液提取，蛋白定量依據Bradfordsmethod以BSA作為標準對照，在570nm波長處測其吸 光度值，計算樣品中的蛋白含量后將每個樣本以RIPA液稀釋為5μg/μl，每個樣本80μl的總 蛋白與20μl蛋白上樣緩沖液混勻后置于100℃沸水煮10min進行變性，蛋白電泳用80V跑濃 縮膠，120V跑分離膠，每個泳道上樣量為40μg/20μl，轉膜采用0.45μmPVDF膜，100V恒壓，4 ℃，1.5h，轉完膜后用TBST將膜浸洗一次，放入5％脫脂奶粉-TBST緩沖液中25℃搖床封閉 1h，封閉完全后，按1∶500稀釋比加入兔抗人CLCA2一抗，4℃搖床慢速震蕩孵育12h，以TBST 緩沖液漂洗后將膜放入按1∶10000稀釋好的山羊抗兔二抗雜交液體中25℃搖床孵育2h，蛋 白條帶用ECL發光液進行顯像，最后用X線暗盒曝光成像，蛋白條帶判定由預染分子量的 Marker提供參考，利用Image-proplus6.0軟件來分析各條帶的OD值。

2.CLCA2蛋白在制備預防和治療宮頸癌的藥物組合物中的應用。