[發明專利]一種山核桃嫁接過程中小RNA測序分析方法

在審

• 申請號: 201610114601.4
• 申請日: 2016-03-01
• 公開（公告）號: CN105648078A
• 公開（公告）日: 2016-06-08
• 發明（設計）人: 鄭炳松;徐棟斌;裘玲玲
• 申請（專利權）人: 浙江農林大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 北京天奇智新知識產權代理有限公司 11340
• 代理人: 韓洪

1.一種山核桃嫁接過程中小RNA測序分析方法，其特征在于：包括如下步驟：

步驟一、材料準備：選取山核桃的嫁接枝條，選取砧木為兩年生的實生苗， 而接穗則是留有一個健壯芽的大概約9cm左右長的一年生的苗，采取后迅速 用錫箔紙包好放入液氮罐，存放-70℃環境中備用；

步驟二、枝條嫁接：將經過步驟一選取的山核桃砧木和接穗進行嫁接；

步驟三、提取總RNA：山核桃完成嫁接后，在0、7、14天對山核桃莖進行 采樣，將采集的樣品迅速用錫箔紙包好放入液氮罐，存放-70℃環境中備用， 并提取樣品的總RNA，總RNA的提取步驟如下：

1)在10ml離心管里面加入0.2ml的β-巰基乙醇和4mlCTAB，然后放入65 ℃的水浴鍋中預熱；

2)在樣品中加入適量的PVP然后用預冷好的研棒磨細，分裝在已經預熱的 離心管里面，每一管大約4藥匙然后利用渦旋儀混勻，然后將離心管放入65 ℃水浴鍋中加熱，期間不時上下顛倒混勻加熱30min，混合均勻后4℃，12000 rpm，離心10min；

3)將離心后的上清液轉入新的10ml離心管里面，再加入等體積的24:1的氯 仿：異戊醇上下顛倒混勻后4℃，12000rpm，離心10min；

4)重復第三步，直至中間層消失；

5)將離心后的上清液轉入新的10ml離心管中，加入等體積的異丙醇，上下 顛倒混勻后在-20℃冰箱中靜置30min～1h；

6)將冷凍的離心管在4℃，12000rpm，離心10min，離心完成后將液體倒掉；

7)在沉淀中加入600ul裂解液RTLPlus，4℃，13000rpm，離心30s，收集上 清液，然后加入0.5倍體積的無水乙醇，吹打混勻；

8)將混合物加入到吸附柱RA中，4℃，13000rpm，離心30s，將廢液倒掉；

9)在吸附柱中加入750ul的去蛋白液RW1，在室溫下放置1min，13000rpm 離心30s，將廢液倒掉；

10)加入600ul的漂洗液RW，13000rpm，離心30s，將廢液倒掉，重復一遍；

11)將吸附柱RA放回到一個新的收集管里面，13000rpm，離心2min，盡可 能的去除漂洗液；

12)將吸附柱AP放到一個干凈滅菌離心管里面，并在吸附膜的中間部位加 40ulddH2O，室溫下放置1min，12000rpm，離心1min，獲得溶解好的RNA；

步驟四、miRNA文庫構建：將經過步驟三提取的三個時期的總RNA樣本分 別標記為G0、G7、G14，G0設為對照組，miRNA文庫的構建具體過程如下：

1)先用1％瓊脂糖的凝膠電泳與紫外分光光度計來檢測RNA質量，用Aligent 2100RNA6000NanoKit來檢測RNA整齊度；

2)接著用15％的聚丙烯酰胺的變性凝膠來分離開小分子RNA，再用小片段 RNA回收的試劑盒來回收并且純化長度為18～30bp之間的RNA，連接5’ 和3’接頭來進行反轉錄合成；

3)最終進行PCR擴增，并且構建這些小分子RNA的cDNA文庫；

步驟五、小RNASolexa測序分析：用IlluminaHiSeqTM2000平臺來進行測 序分析，預測分析包括保守miRNA和新的miRNA序列預測及分析、山核桃 miRNA差異表達分析和miRNA與靶基因qRT-PCR檢測。

2.如權利要求1所述的一種山核桃嫁接過程中小RNA測序分析方法，其特征在 于：所述的步驟三的2)中利用渦旋儀混勻的混勻時間為1min，上下顛倒混 勻間隔時間為10min。

3.如權利要求1所述的一種山核桃嫁接過程中小RNA測序分析方法，其特征在 于：所述的步驟四的2)中5’為5’-RACE-ReadycDNA，3’為3’-RACE-Ready cDNA。