[發(fā)明專利]一種山核桃嫁接過程中小RNA測序分析方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201610114601.4
• 申請日: 2016-03-01
• 公開（公告）號: CN105648078A
• 公開（公告）日: 2016-06-08
• 發(fā)明（設計）人: 鄭炳松;徐棟斌;裘玲玲
• 申請（專利權）人: 浙江農林大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 北京天奇智新知識產權代理有限公司 11340
• 代理人: 韓洪

【技術領域】

本發(fā)明涉及山核桃無性繁殖栽培技術的領域，特別涉及一種山核桃嫁接過 程中小RNA測序分析方法。

【背景技術】

山核桃是胡桃科山核桃屬的一種油料木本樹種，主要生長于浙西，是該地 區(qū)的一種具有特色的干果，它的經濟價值比較高，由于山核桃具有童期較長， 不容易采收以及園藝栽培困難等問題，阻礙了山核桃的產業(yè)發(fā)展。但是植物嫁 接手段無性繁殖里面比較重要阻礙了山核桃的產業(yè)發(fā)展。但是植物嫁接手段無 性繁殖里面比較重要栽培技術，是解決山核桃采收困難和園藝化栽培的重要手 段。

小RNA是一種長度大約為21-24nt的非編碼RNA分子，以往的研究表明小 RNA在基因表達、基因組表觀遺傳修飾等方面起著十分重要的調控作用。一般 來說，小RNA分子是由雙鏈RNA或者分子內雙鏈RNA這兩種形式的轉錄前體 產生的。目前已知的小RNA主要分為兩大類，也就是miRNA(microRNA)和 siRNA(smallinterferingRNA)，這些小RNA對植物的生長發(fā)育，維持基因組的 穩(wěn)定性以及適應外界環(huán)境的各種脅迫等方面都有著至關重要的作用。

在植物中miRNA的靶基因是可以編碼調控蛋白的一種轉錄因子，我們由此 可知在植物中miRNA主要是一種調控因子，對基因表達調控中起著重要作用。 根據目前已有的研究，miRNA在植物信號轉導、器官的形態(tài)建成、生長發(fā)育及 外界環(huán)境脅迫應答等生物學過程都起著重要的作用。因此，分析小RNA的組成 以及分布情況在山核桃嫁接過程中所起的功能作用具有重要意義，為了提高山 核桃在嫁接過程中的嫁接成功率，有必要提出一種山核桃嫁接過程中小RNA測 序分析方法。

【發(fā)明內容】

本發(fā)明的目的在于克服上述現(xiàn)有技術的不足，提供一種山核桃嫁接過程中 小RNA測序分析方法，其旨在解決現(xiàn)有技術中對小RNA的組成以及分布情況 在山核桃嫁接過程中所起的功能作用探索和分析較少的技術問題。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提出了一種山核桃嫁接過程中小RNA測序分析方 法，包括如下步驟：

步驟一、材料準備：選取山核桃的嫁接枝條，選取砧木為兩年生的實生苗， 而接穗則是留有一個健壯芽的大概約9cm左右長的一年生的苗，采取后迅速用 錫箔紙包好放入液氮罐，存放-70℃環(huán)境中備用；

步驟二、枝條嫁接：將經過步驟一選取的山核桃砧木和接穗進行嫁接；

步驟三、提取總RNA：山核桃完成嫁接后，在0、7、14天對山核桃莖進行 采樣，將采集的樣品迅速用錫箔紙包好放入液氮罐，存放-70℃環(huán)境中備用，并 提取樣品的總RNA，總RNA的提取步驟如下：

1)在10ml離心管里面加入0.2ml的β-巰基乙醇和4mlCTAB，然后放入 65℃的水浴鍋中預熱；

2)在樣品中加入適量的PVP然后用預冷好的研棒磨細，分裝在已經預熱的 離心管里面，每一管大約4藥匙然后利用渦旋儀混勻，然后將離心管放入65℃ 水浴鍋中加熱，期間不時上下顛倒混勻加熱30min，混合均勻后4℃，12000rpm， 離心10min；

3)將離心后的上清液轉入新的10ml離心管里面，再加入等體積的24:1的 氯仿：異戊醇上下顛倒混勻后4℃，12000rpm，離心10min；

4)重復第三步，直至中間層消失；

5)將離心后的上清液轉入新的10ml離心管中，加入等體積的異丙醇，上 下顛倒混勻后在-20℃冰箱中靜置30min～1h；

6)將冷凍的離心管在4℃，12000rpm，離心10min，離心完成后將液體倒 掉；

7)在沉淀中加入600ul裂解液RTLPlus，4℃，13000rpm，離心30s，收集 上清液，然后加入0.5倍體積的無水乙醇，吹打混勻；

8)將混合物加入到吸附柱RA中，4℃，13000rpm，離心30s，將廢液倒掉；

9)在吸附柱中加入750ul的去蛋白液RW1，在室溫下放置1min，13000rpm 離心30s，將廢液倒掉；

10)加入600ul的漂洗液RW，13000rpm，離心30s，將廢液倒掉，重復一 遍；

11)將吸附柱RA放回到一個新的收集管里面，13000rpm，離心2min，盡 可能的去除漂洗液；