[發明專利]一種豬偽狂犬病毒變異毒株的PCR鑒別方法

在審

• 申請號: 201610113660.X
• 申請日: 2016-02-29
• 公開（公告）號: CN105648116A
• 公開（公告）日: 2016-06-08
• 發明（設計）人: 姜平;孫濤;白娟;王先煒;李玉峰
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68
• 代理公司: 濟南泉城專利商標事務所 37218
• 代理人: 劉麗

技術領域

本發明涉及生物毒株鑒別技術領域，特別涉及一種豬偽狂犬病毒變異毒株的PCR鑒別方 法。

背景技術

偽狂犬病毒(PseudorabiesVirus,PRV)是皰疹病毒科，α皰疹病毒亞科的雙股DNA病 毒，基因組在140kd左右，編碼69個開放閱讀框。該病毒主要引起母豬流產、死胎及呼吸系 統癥狀，仔豬出現神經癥狀和腹瀉，給養豬業造成了巨大的經濟損失。目前，歐美洲很多國 家通過免疫接種和凈化技術已經根除該病。我國近十多年內通過采用強化免疫和凈化技術， 該病也得到有效控制。但是，2011年末，我國PRV疫苗免疫豬場再次暴發該病。全基因組分 析結果也表明，此次新發的偽狂犬病病毒與之前的經典偽狂犬病毒屬于不同的亞群，其抗原 性發生了變化，變異毒株位于一個新的基因分支。因此建立PRV變異毒株和經典毒株鑒別方 法十分必要。

目前現有的檢測偽狂犬病毒感染的PCR方法有很多，其中最常用的兩種是國標法與偽狂 犬gE基因檢測法。國標法主要針對偽狂犬病毒gD基因，可以特異的擴增出220bp的片段。 因為gD基因是偽狂犬病毒感染過程中一個重要的囊膜蛋白，包括疫苗毒與野毒在內的各種 類型的偽狂犬病毒(gD缺失的偽狂犬病毒除外)都存在該基因，所以該方法可以用于鑒別偽 狂犬病毒的感染與否，但不能夠區分疫苗毒與野毒株。而偽狂犬病毒gE基因檢測法主要用于 鑒別疫苗毒與野毒株，野毒株可以擴增出632bp的片段，而疫苗毒由于缺失了gE基因，所以 不能擴增出相應的片段。因為現階段豬場都有Bartha-K61等疫苗免疫，所以國標方法不再適 合進行鑒別，而用于區分疫苗毒與野毒的偽狂犬病毒gE基因檢測法得到了很好的應用，但是 由于偽狂犬病毒變異毒株的出現，使這一方法受到了局限。該方法不能夠區分出變異毒株與 經典毒株，而變異毒株與經典毒株的區分在免疫與監測上又至關重要，所以需要一種可以有 效區分偽狂犬病毒經典毒株與變異毒株的PCR診斷方法。

發明內容

為了有效的預控偽狂犬病的發生，區分出經典毒株與變異毒株的感染及其流行的區域至 關重要。本研究通過不同毒力毒株全基因組序列比對，找到了經典毒株與變異毒株的基因差 異區域UL44和UL36，設計PCR引物，建立了兩步法PCR，具有較高特異性和敏感性，可 用于鑒別PRV經典毒株與變異毒株，為該病診斷提供了有效方法。

本發明是通過以下步驟得到的：

一種豬偽狂犬病毒變異毒株的PCR鑒別方法，提取待鑒別病毒DNA，使用引物1F-C、1F-V、 1R進行第一步擴增，擴增出兩條條帶的為變異株或HB98疫苗毒株，擴增出1條條帶的為經 典毒株；擴增出兩條條帶的病毒DNA再使用引物2F和2R進行第二步擴增，擴增產物分子量 大小為293bp的為變異株,擴增產物分子量大小為239bp的為HB98疫苗毒株；

引物1F-C、1F-V、1R、2F和2R序列如下：

1F-C：5’-GAGCCCGTCTCGGGGACGAC-3’，

1F-V：5’-GCTGCTCGAGGCGGACCACGTC-3’，

1R：5’-CCGGTGCGCGTGCCTGTGG-3’，

2F:5’-GATGCGGTCACCGTCGGGTTT-3’，

2R:5’-CCGCCGCTCAGCCCCCATCGT-3’。