[發明專利]一種豬偽狂犬病毒變異毒株的PCR鑒別方法

在審

• 申請號: 201610113660.X
• 申請日: 2016-02-29
• 公開（公告）號: CN105648116A
• 公開（公告）日: 2016-06-08
• 發明（設計）人: 姜平;孫濤;白娟;王先煒;李玉峰
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68
• 代理公司: 濟南泉城專利商標事務所 37218
• 代理人: 劉麗

1.一種豬偽狂犬病毒變異毒株的PCR鑒別方法，其特征在于提取待鑒別病毒DNA，使用引物1F-C、1F-V、1R進行第一步擴增，擴增出兩條條帶的為變異株或HB98疫苗毒株，擴增出1條條帶的為經典毒株；擴增出兩條條帶的病毒DNA再使用引物2F和2R進行第二步擴增，擴增產物分子量大小為293bp的為變異株,擴增產物分子量大小為239bp的為HB98疫苗毒株；

引物1F-C、1F-V、1R、2F和2R序列如下：

1F-C：5’-GAGCCCGTCTCGGGGACGAC-3’，

1F-V：5’-GCTGCTCGAGGCGGACCACGTC-3’，

1R：5’-CCGGTGCGCGTGCCTGTGG-3’，

2F:5’-GATGCGGTCACCGTCGGGTTT-3’，

2R:5’-CCGCCGCTCAGCCCCCATCGT-3’。

2.根據權利要求1所述的PCR鑒別方法，其特征在于第一步PCR反應體系：Taqmix12.5μl，0.1μlrTaq，蒸餾水1.5μl，DMSO2.5μl，10uM的上游引物1F-C、下游引物1F-V、鑒別引物1R分別為0.5μl、2μl、5μl，DNA模板1μl。

3.根據權利要求1或2所述的PCR鑒別方法，其特征在于第一步PCR反應條件：95℃預變性5min；95℃變性30s，70℃退火30s，72℃延伸1min，10個循環；65℃退火30s，72℃延伸1min，10個循環；60℃退火30s，72℃延伸1min，15個循環；最后72℃終延伸10min。

4.根據權利要求1所述的PCR鑒別方法，其特征在于第二步PCR反應體系：Taqmix12.5μl，蒸餾水6.5μl，DMSO1μl，10uM上游引物F’、下游引物R’分別為2μl、2μl，DNA模板1μl。

5.根據權利要求1或4所述的PCR鑒別方法，其特征在于第二步PCR反應條件：95℃預變性5min；95℃變性30s，68℃退火30s，72℃延伸30s，共35個循環；最后72℃終延伸10min。

6.根據權利要求1-5中任一項所述的PCR鑒別方法，其特征在于第一次PCR的敏感度達到2-20TCID₅₀病毒量或0.5ng/ml質粒量。

7.根據權利要求1-5中任一項所述的PCR鑒別方法，其特征在于第二次PCR敏感度達到50TCID₅₀病毒量或者100ng/ml質粒量。

8.根據權利要求1-5中任一項所述的PCR鑒別方法，其特征在于準確率達到91%到100%。