[發(fā)明專利]蛹蟲草斜面固體菌種有效替代液體菌種的蛹蟲草培養(yǎng)方法

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• 申請日: 2016-03-01
• 公開（公告）號: CN105733957A
• 公開（公告）日: 2016-07-06
• 發(fā)明（設計）人: 王建瑞;段騰益;王勇超;劉宇;劉承;程顯好
• 申請（專利權）人: 魯東大學
• 主分類號: C12N1/14
• 分類號: C12N1/14;A01G1/04;C12R1/645
• 代理公司: 煙臺雙聯(lián)專利事務所(普通合伙) 37225
• 代理人: 梁翠榮

技術領域：

本發(fā)明涉及蛹蟲草斜面固體菌種有效替代液體菌種的蛹蟲草培養(yǎng)方法，屬于生物技術領域。

背景技術：

蛹蟲草，又名北冬蟲夏草，麥角菌科蟲草屬，是我國名貴中藥材之一。現(xiàn)代藥學研究表明蛹蟲草中含有核苷類、多糖類、蟲草素、甾醇類等成分含量基本與冬蟲夏草相同，對免疫系統(tǒng)，神經(jīng)系統(tǒng)及心血管系統(tǒng)等疾病具有治療效果，并有抗腫瘤和抗癌作用，是冬蟲夏草理想的替代品，有廣闊的發(fā)展前景。

目前大多數(shù)生產(chǎn)企業(yè)使用液體菌種來工廠化生產(chǎn)蛹蟲草，但是由于存在菌種退化問題導致應用于工廠化生產(chǎn)的菌株存在未知的問題，不易于人工肉眼觀察。為了克服這種潛在的問題大多數(shù)企業(yè)在將蛹蟲草液體菌種用于生產(chǎn)前都進行DNS測酶的活性的方法來避免工廠化生產(chǎn)過程中造成的大量損失。但是這種方法存在較多問題，比如說在培養(yǎng)過程的后期退化導致液體菌種有較多的孢外酶影響測量結果；這種方法對人員的科學素質及儀器的精密度有很大關系，很多企業(yè)會因此投入大部分資金降低了利潤。且蛹蟲草在液體培養(yǎng)基中會產(chǎn)生大量分生孢子，同樣也不易觀察培養(yǎng)基中分生孢子含量。

在市場中存在兩種不同名字的蛹蟲草，一種被人們稱作蟲草花，這種蛹蟲草是在糧食培養(yǎng)基中制作的，雖然說蟲草素含量高有藥用價值，但是沒有列入中國藥典因此價格較低；另一種被人們稱作蛹蟲草或北冬蟲夏草，這種蛹蟲草是在蠶蛹體內生長趨向于野生賣相較好，并且納入中國藥典，所以價格較高，但是培養(yǎng)難度較大，成本較高導致無法進行大規(guī)模工廠化生產(chǎn)。

現(xiàn)在蠶蛹蛹蟲草栽培過程中蛹的僵化率直接影響出草率，進而影響生產(chǎn)的經(jīng)濟收入，現(xiàn)在蛹蟲草栽培過程中母種的培養(yǎng)主要是以馬鈴薯、牛肉膏、和蛋白胨為主要原料配制而成，營養(yǎng)成分單一，菌種生長速度慢，同時易發(fā)生遺傳變異，蛹的僵化率低，產(chǎn)量不穩(wěn)定等問題存在。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的在于克服上述已有技術的不足而提供一種操作簡單，培養(yǎng)周期短，子實體產(chǎn)率高，無污染無廢棄物，可以進行工廠化生產(chǎn)的將蛹蟲草斜面固體菌種有效替代液體菌種的蛹蟲草培養(yǎng)方法。

本發(fā)明的目的可以通過如下措施來達到：蛹蟲草斜面固體菌種有效替代液體菌種的蛹蟲草培養(yǎng)方法，其特征在于其包括如下步驟：

（一）菌種準備：

低溫保藏蛹蟲草菌種:蛹蟲草菌種蛹蟲草5.701，來源于中國普通微生物菌種保藏管理中心;

（二）蛹蟲草胡蘿卜斜面菌種（母種）培養(yǎng)：

（1）配制培養(yǎng)基：按重量份將200份胡蘿卜切成0.8-1.2cm的小塊，在沸水中煮20分鐘，然后進行過濾，取汁，后加入葡萄糖20份，硫酸鎂0.5份，磷酸二氫鉀1份，瓊脂20份，融化后，定容成1000mL，自然pH值；

（2）培養(yǎng)基分裝，滅菌：

將配制好的培養(yǎng)基分裝于18mm×180mm試管中，封口，在121℃條件下，滅菌20min；

（3）冷卻，接種：

滅完菌后取出培養(yǎng)基，自然冷卻至20℃-30℃，在無菌條件下，接入蛹蟲草菌種；

（4）培養(yǎng)：

將接好種的培養(yǎng)基置于恒溫培養(yǎng)箱里，25℃培養(yǎng)12天，菌絲充分生長；

（5）挑選：

將長勢較好沒有出現(xiàn)退化現(xiàn)象的蛹蟲草胡蘿卜斜面菌種選出；

（三）接種：

將蛹蟲草胡蘿卜斜面菌種在無菌操作下轉移到一次性注射針管中，并吸入葡萄糖注射液，再將蛹蟲草胡蘿卜斜面菌種與葡萄糖注射液混合后的溶液從針頭擠出再將擠出的溶液倒回一次性注射針管中，再次將溶液從針頭擠出再將擠出的溶液倒回一次性注射針管中，再將溶液從針頭擠出再將擠出的溶液倒回一次性注射針管中；直至蛹蟲草胡蘿卜斜面菌種與葡萄糖注射液充分混勻，制成蛹蟲草液體固化菌種；將蛹蟲草液體固化菌種接入糧食培養(yǎng)基或蠶蛹；每瓶糧食培養(yǎng)基接入5mL蛹蟲草液體固化菌種；每只蠶蛹接0.1mL蛹蟲草液體固化菌種；

（四）培養(yǎng)：

將上述接好種的蛹蟲草培養(yǎng)基或接好種的蠶蛹置于恒溫培養(yǎng)箱里進行培養(yǎng)。

為了進一步實現(xiàn)本發(fā)明的目的，所述的糧食培養(yǎng)基由小麥40g，水50mL配制而成，自然pH值；且將配制好的糧食培養(yǎng)基分裝于500ml罐頭瓶中，食用菌專用封口膜封口，在121℃條件下滅菌20分鐘；滅完菌后取出糧食培養(yǎng)基，自然冷卻至20℃-30℃；將蛹蟲草液體固化菌種接入冷卻后的糧食培養(yǎng)基，置于恒溫培養(yǎng)箱里，16-18℃培養(yǎng)8-12天，菌絲充分生長后，轉移到18-20℃、相對濕度85-95%、每天11-13小時散射光條件下培養(yǎng)50—90天；將長出的子實體用鑷子采出，去掉子實體連接的培養(yǎng)基進行子實體的采收。