[發(fā)明專利]一種利用熒光檢測微囊藻細(xì)胞DNA損傷的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610109195.2
• 申請日: 2016-02-26
• 公開（公告）號: CN105543399B
• 公開（公告）日: 2019-07-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 吳振斌;魯志營;劉碧云;何燕;賀鋒;周巧紅;徐棟;張甬元
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院水生生物研究所
• 主分類號: C12Q1/6858
• 分類號: C12Q1/6858;C12Q1/6806
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務(wù)所 42001
• 代理人: 王敏鋒

本發(fā)明公開一種利用熒光檢測微囊藻細(xì)胞DNA損傷的方法，其步驟：（a）將待檢測樣品和對照樣品均分別平均分成三小組；（b）去除細(xì)胞角質(zhì)鞘：離心收集樣品中藻細(xì)胞并重懸浮于SE緩沖液中洗滌；（c）細(xì)胞裂解：將細(xì)胞分別重懸浮于Lysis裂解液，加入蛋白酶K和十二烷基磺酸鈉，使細(xì)胞裂解；（d）細(xì)胞DNA鏈解旋：改變pH，使T、P和B樣品在不同條件下解旋；（e）染色：分別向以上T、P和B樣品中加入Hoechest 33258染色；（f）熒光測定：離心后于熒光檢測器中檢測上清液的熒光強(qiáng)度；（g）結(jié)果計(jì)算：根據(jù)待測樣品和對照樣品中T、B和P樣品的熒光來計(jì)算DNA鏈的斷裂水平。本方法易于掌握，并且靈敏度高，DNA鏈上單個(gè)斷裂位點(diǎn)即可檢測到。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及環(huán)境檢測與生態(tài)毒理評價(jià)技術(shù)領(lǐng)域，更具體涉及一種微囊藻細(xì)胞DNA損傷檢測的方法，它適用于水體中有毒有害物質(zhì)的生態(tài)安全評價(jià)及水環(huán)境中致癌致畸因子的早期監(jiān)測預(yù)警。

背景技術(shù)

隨著水體富營養(yǎng)化的加劇，藍(lán)藻水華現(xiàn)象時(shí)常發(fā)生。藍(lán)藻水華造成水質(zhì)急劇惡化，魚類大量死亡，生境退化。微囊藻作為水華的主要藻種之一，不僅增殖能力強(qiáng)，而且產(chǎn)生微囊藻毒素，導(dǎo)致家畜死亡，也可能引發(fā)人類肝臟癌變。DNA作為中心法則的核心，對細(xì)胞的分裂、代謝與調(diào)控起著決定性作用，DNA損傷作為一個(gè)靈敏而有代表性的生物標(biāo)志物，廣泛應(yīng)用于生態(tài)毒理與安全評價(jià)中。針對不同控藻方法的微囊藻DNA損傷評估，不僅有助于藍(lán)藻水華控制技術(shù)的開發(fā)；同時(shí)，微囊藻對環(huán)境中致癌致畸因子響應(yīng)靈敏，通過對微囊藻DNA損傷的檢測，可實(shí)現(xiàn)對水體環(huán)境中致癌致畸因子的早期監(jiān)測預(yù)警。

目前還沒有專門針對微囊藻細(xì)胞DNA損傷檢測的方法。Singh等(“A simpletechnique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells”.Singh et al.,Experimental Cell Research,卷:175期:1頁:184-191,1988年3月15日)在前人方法的基礎(chǔ)上，提出了單細(xì)胞凝膠電泳法測定細(xì)胞DNA損傷。該方法簡便，靈敏，在醫(yī)學(xué)和毒理學(xué)檢測研究中有較多的應(yīng)用。然而，該方法只能檢測單鏈DNA損傷，并且操作主觀性強(qiáng)，不同操作者實(shí)驗(yàn)結(jié)果偏差較大，因而限制了這一方法的廣泛應(yīng)用。最近，有一些學(xué)者提出了利用PCR擴(kuò)增的方式來檢測DNA鏈斷裂的方法，如RAPD、rDNA和ARDRA(“Evidencesshowing ultraviolet-B radiation-induced damage of DNA in cyanobacteria andits detection by PCR assay”.Kumar.,et al,Biochemical and Biophysical ResearchCommunications,卷:318期：4頁:1025-1030,2004年6月11日)，以及通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR(“DNA supercoiling suppresses real-time PCR:a new approach to thequantification of mitochondrial DNA damage and repair”.Chen et al.,NucleicAcids Research,卷:35期:4頁:1377-1388,2007年2月11日)的辦法來定量DNA損傷的程度，這些方法在特定細(xì)胞DNA鏈斷裂檢測中顯示了很高的特異性，但應(yīng)用藻類DNA損傷中還有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)，并且該方法操作難度大，需要大型儀器如熒光定量PCR儀，測試費(fèi)用高，難以普遍應(yīng)用于環(huán)境檢測。本方法是根據(jù)不同斷裂水平的DNA鏈在堿性溶液中解旋速率不同，通過熒光染色對解旋后DNA鏈中雙鏈部分進(jìn)行定量來測定細(xì)胞DNA損傷。其原理為：DNA鏈斷裂后，自由末端增多，雙鏈DNA在適宜的堿性pH值下氫鍵斷裂，雙鏈DNA解鏈，自由末端越多，解旋速率越快。雙鏈DNA熒光染料Hoechst 33258能選擇性的與雙鏈DNA結(jié)合，而不與單鏈DNA結(jié)合，由此可以計(jì)算DNA單雙鏈的比例，通過比較相同解旋時(shí)間后DNA單雙鏈的比例，來計(jì)算DNA鏈斷裂的水平。本方法不會(huì)受到染色體結(jié)構(gòu)的影響，并且靈敏度高，可以檢測到染色體上的單個(gè)斷裂位點(diǎn)，因此非常適合測定浮游生物DNA鏈斷裂。

發(fā)明內(nèi)容