[發明專利]一種利用熒光檢測微囊藻細胞DNA損傷的方法

有效

• 申請號: 201610109195.2
• 申請日: 2016-02-26
• 公開（公告）號: CN105543399B
• 公開（公告）日: 2019-07-16
• 發明（設計）人: 吳振斌;魯志營;劉碧云;何燕;賀鋒;周巧紅;徐棟;張甬元
• 申請（專利權）人: 中國科學院水生生物研究所
• 主分類號: C12Q1/6858
• 分類號: C12Q1/6858;C12Q1/6806
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所 42001
• 代理人: 王敏鋒

1.一種利用熒光檢測微囊藻細胞DNA損傷的方法，其步驟是：

(a)分組設定：除待檢測樣品外設置正常生長的樣品為對照組，待檢測樣品標記為t，對照樣品標記為0，將待檢測樣品和對照樣品分別平均分成三組，測試樣品標記為P_t樣品、T_t樣品和B_t樣品；對照樣品分別標記為P₀樣品、T₀樣品和B₀樣品，在以下步驟(b)至(f)中，對測試樣品和對照樣品處理方式相同，在以下步驟(b)至(f)的表述中，T樣品包含T_t樣品和T₀樣品，P樣品包含P_t樣品和P₀樣品，B樣品包含B_t樣品和B₀樣品；

(b)去除細胞角質鞘：1500×g離心15min收集T、P和B樣品中藻細胞，將細胞重懸浮于1mL SE緩沖液：SE緩沖液的配制方法：50mM NaCl，50mM Tris，5mM EDTA，調pH至8.0顛倒混勻洗滌2～5min；

(c)細胞裂解：1500×g離心15min，去上清液，將細胞分別重懸浮于415V體積的Lysis裂解液：Lysis裂解液的配制方法：40mM EDTA，400mM NaCl，50mM Tris-HCl，pH＝9.0，分別加入50V體積的濃度為50mg/ml溶菌酶，上下顛倒樣品管三次，37℃反應20min；然后加入10V體積濃度為5mg/ml的蛋白酶K和25V體積濃度為10％的十二烷基磺酸鈉，上下顛倒樣品管三次，50℃反應2h；

(d)細胞DNA鏈解旋：T樣品加入1000V體積的超純水，混勻；B樣品加入500V體積的0.1MNaOH混勻，超聲處理180s，20℃溫浴30min，隨后加入500V體積的0.1M HCl，混勻；P樣品，加入500V體積的0.1M NaOH混勻，20℃溫浴30min，隨后加入500V體積的0.1M HCl，混勻；

(e)染色：分別向以上T、P和B樣品中加入100V體積的60μM Hoechest33258：溶解于0.1M磷酸緩沖液中，pH＝7.6，混勻，25～30℃下10000rpm離心5min，整個過程避光；

(f)熒光測定：根據不同檢測器分別取對應量T、P和B樣品上清液，于熒光檢測器中測熒光強度，T、P和B樣品的熒光強度分別記為f_P、f_B和f_T；

(g)結果計算：DNA鏈斷裂指數SSF的計算：

首先，計算殘留雙鏈DNA百分比F，F＝(f_P－f_B)/(f_T－f_B)×100％

然后，根據所計算出的F值計算DNA鏈斷裂指數，計算公式為

SSF＝-ln(F_t/F₀)

其中，F₀為對照組的F值，由對照組的P₀樣品、T₀樣品和B₀樣品的熒光強度f計算得到；F_t為處理組的F值，由處理組P_t樣品、T_t樣品和B_t樣品的熒光計算強度f得到。