[發明專利]一種基因組混樣測序文庫的制備方法

在審

• 申請號: 201610108049.8
• 申請日: 2016-02-26
• 公開（公告）號: CN105671644A
• 公開（公告）日: 2016-06-15
• 發明（設計）人: 張洪源;鄭媛坤;束禮平;楊冰;范藝翔;王宇峰;何銀竹;束禮偉;黃剛;董揚
• 申請（專利權）人: 武漢冰港生物科技有限公司
• 主分類號: C40B50/06
• 分類號: C40B50/06;C12Q1/68
• 代理公司: 北京世譽鑫誠專利代理事務所(普通合伙) 11368
• 代理人: 郭官厚

技術領域

本發明涉及分子生物學中高通量測序技術的領域。更具體涉及一種基因組混樣測 序文庫的制備方法，它適用于所有真核生物各種樣本的重測序或者簡化測序，尤其適用于 小基因多樣本數的重測序或者大基因群體的簡化測序。

背景技術

二代測序技術是目前現高通量測序研究中最常用的技術。DNA測序技術經過30多 年的發展已經取得重大進展，以高通量為特點的第二代測序技術已經逐步成熟并且商業 化。早期的測序技術主要依賴第一代測序，一代測序從傳統的化學降解法、雙脫氧鏈終止法 以及在它們的基礎上發展來的各種DNA測序技術統稱為第一代DNA測序技術，其中Sanger法 因操作簡便，對單個序列檢測較快且準確率較高，目前仍得到廣泛的應用。第一代測序技術 在分子生物學研究中發揮過重要的作用，如人類基因組計劃(HumanGenomeProject,HGP) 主要基于第一代DNA測序技術完成。但隨著人類基因組計劃以及其他模式生物的測序工作 的完成，我們進入了后基因組時代即功能基因組時代，傳統的一代測序方法已經不能滿足 深度測序和重測序等大規模基因組高通量測序的需求，因此，人類發展出來第二代測序技 術。

第二代測序技術主要包括羅氏454公司的GSFLX測序平臺、ABI公司的SOLiD測序 平臺和Illumina公司的SolexaGenomeAnalyzer測序平臺以及Solexa的升級版Hiseq測序 平臺等。第二代測序技術最顯著的特征是高通量，一次能對幾十萬到幾百萬條DNA分子序列 進行測序，使得對一個物種的轉錄組測序或基因組深度測序變得方便易行。第二代測序技 術的主要原理是先將的基因組DNA進行片段化，在兩側加上各自特異的接頭，隨后用不同的 方法產生幾百萬個空間固定的PCR克隆陣列，然后進行引物雜交和酶延伸反應，對每個延伸 反應所摻入的熒光標記進行成像檢測就可獲取測序數據。454測序的特點是單次讀長長大， 但單次反應的數據量低。SOLiD測序讀長為50bp，單次反應的數據量50G，特點是高通量和高 準確度，但成本較高。而Illumina公司的Solexa測序讀長為雙端讀長2×50bp，單次反應的 數據量20G，測序成本較低，性價比高。Solexa的升級版Hiseq和桌面式測序儀Miseq以及 Nextseq經過近幾年的一系列版本的發展，測序通量一致在不斷提高，其中Hiseq從早期 Hiseq1000和Hiseq2000已經發展到目前的Hiseq2500和Hisq3000/4000等，Hiseq測序平臺 單次反應可以產生的數據量由300-600G已提升到1.5Tb，雙端讀長也有50bp提升到了 150bp，極大的提升了測序通量，同時降低了測序價格，使得1000美金測一個人類基因組成 為了可能。

隨著測序技術的發展，測序儀的通量也會隨之上升，測序價格也相應降低，大規模 多樣本數的基因重測序也已實現。但對于一些小基因組，例如真菌基因組大小約2.5～ 81.15Mb和細胞器基因組如葉綠體基因組大小為120K～217K等，當測序樣本數較多時，測序 數據量若小于2G時，若對單個文庫建單獨建庫測序，單個樣本文庫的構建成本將超過其測 序成本。本發明專利基于Illumina公司第二代測序平臺，設計了含有新的標簽(Barcode)序 列的接頭和含索引(Index)序列的PCR引物，結合NewEnglandBioLabs(NEB)公司的建庫試 劑，并對建庫流程進行改進和優化，設計了一種對多個樣本同時構建的混合建庫方法，節約 了建庫成本，同時也提高了建庫效率。

發明內容

本發明的目的在于提供了一種基因組混樣測序文庫的制備方法，我們將設計了多 對含有標簽(Barcode)序列的接頭和含索引(Index)序列的PCR引物對每種打斷后的DNA片 段進行標記混樣和文庫構建，這種方式節約了建庫試劑，提高了建庫的效率。此外，本發明 專利設計兼容Illumina二代測序儀特異的接頭連接后為雙端標簽(Barcode)，增強了接頭 互補堿基數，提高了連接效率，可對樣品進行精確標記。本發明普遍適于常規分子生物學實 驗室進行各種樣本的重測序或者簡化測序，尤其適用于小基因多樣本數的重測序或者大基 因群體的簡化測序。

為了實現上述的目的，本發明采用以下技術方案：