[發明專利]一種基因組混樣測序文庫的制備方法

在審

• 申請號: 201610108049.8
• 申請日: 2016-02-26
• 公開（公告）號: CN105671644A
• 公開（公告）日: 2016-06-15
• 發明（設計）人: 張洪源;鄭媛坤;束禮平;楊冰;范藝翔;王宇峰;何銀竹;束禮偉;黃剛;董揚
• 申請（專利權）人: 武漢冰港生物科技有限公司
• 主分類號: C40B50/06
• 分類號: C40B50/06;C12Q1/68
• 代理公司: 北京世譽鑫誠專利代理事務所(普通合伙) 11368
• 代理人: 郭官厚

1.一種基因組混樣測序文庫的制備方法，包括以下步驟：

(1)對需要混樣測序樣品的基因組DNA進行超聲打斷，打斷的插入片段為350bp；

(2)對超聲打斷的片段進行純化，利用NEB末端修復試劑對純化產物進行末端修復；

(3)對末端修復產物進行純化，利用特異的含不同標簽(Barcode)接頭序列分別對純化 產物進行連接反應，連接試劑采用NEB快速連接試劑；

接頭的序列如下：

P5-P7-F(5’-3’)：ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNN*T

P5-P7-R(5’-3’)：/5Phos/YYYYYAGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTC

其中，設計的P5-P7-R引物中的五堿基序列YYYYY與P5-P7-F引物中的五堿基序列NNNNN 反向互補，其中NNNNN代表標簽(Barcode)序列(表1)，主要用于標記混樣各個樣本；

(4)對上述連接產物進行純化，對后續需要混樣的純化產物逐一進行濃度測定；

(5)參照上述純化產物的濃度和總量，依據所測樣本的測序量對純化產物進行混合，混 合后進行片段篩選，片段篩選采用瓊脂糖電泳和切膠回收的方法；

(6)利用含索引(Index)序列的PCR引物對上述的回收片段進行PCR擴增，PCR產物利用 1.6倍體積的磁珠純化兩次，純化后的產物即為測序文庫；

PCR引物序列為：

F(5’-3’):AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC，

R(5’-3’):CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC，

其中，PCR引物R序列中的NNNNNN代表索引(Index)序列，索引用于標記不同的混樣文 庫，不同混樣文庫選用不同的索引(Index)引物；

(7)純化PCR產物進行純化回收即可得到測序文庫；

(8)對上述測序文庫進行濃度和片段大小范圍檢測；將文庫濃度將檢測合格后的文庫 利用Illumina公司的二代測序儀進行高通量測序。

2.根據權利要求1所述的一種基因組混樣測序文庫的制備方法，其特征在于：所述步驟 (1)中，打斷范圍為插入片段350bp，可選用超聲打斷儀CovarisM220，占空因數(Duty factor20％)，峰值功率(Peakincidentpower，50W)，循環破碎系數(Cyclesperburst， 200)，持續時間65秒，工作溫度20度(℃)，不同的樣品的基因組DNA的起始量相同，起始量為 100～500ng之間，打斷體系為50μL。

3.根據權利要求1所述的一種基因組混樣測序文庫的制備方法，其特征在于：所述步驟 (2)中，采用NEB修復試劑，體系為修復試劑0.75μl，10倍濃度(10×)的修復緩沖液2μL，片段 DNA溶液17.25μL，總體系為20μL，修復條件為20度℃，60分鐘(min)；65℃，30min；4℃，終止 (hold)。

4.根據權利要求1所述的一種基因組混樣測序文庫的制備方法，其特征在于：所述步驟 (3)中，設計了不同標簽(Barcode)的特異接頭引物(共10種，表1)，采用NEB連接反應試劑， 體系為10×T4DNA連接酶緩沖液2μL，加A連連接液3.75μL，接頭(濃度為15μM)1μL，連接增強 液0.25μL，修復DNA溶液18μL，總體系25μL，連接條件為20℃，90min；4度，hold。

5.根據權利要求1所述的一種基因組混樣測序文庫的制備方法，其特征在于：所述步驟 (5)中，混樣根據每個需要測量大小來確定，若所測數據量相同，可進行等量混合；電泳條件 為2％瓊脂糖凝膠電泳，電泳條件為120V，1.5小時(h)，切取350-500bp之間的片段進行回 收。