[發明專利]限制性凝血酶的制備方法

有效

• 申請號: 201610107662.8
• 申請日: 2016-02-26
• 公開（公告）號: CN105624134B
• 公開（公告）日: 2019-05-21
• 發明（設計）人: 黃宏寶;黃發燦;鄭登忠;郭曉乾;章麗麗
• 申請（專利權）人: 福建華燦制藥有限公司
• 主分類號: C12N9/74
• 分類號: C12N9/74
• 代理公司: 福州市博深專利事務所(普通合伙) 35214
• 代理人: 林志崢

本發明提供一種純度高、比活高的限制性凝血酶的制備方法，利用陰離子交換層析介質從豬血漿中吸附凝血酶原，對陰離子層析柱進行洗脫，活化凝血酶原，得凝血酶粗溶液，經超濾濃縮，得凝血酶濃縮液，再用陽離子交換層析介質吸附凝血酶，對陽離子層析柱進行洗脫，得凝血酶溶液，經超濾脫鹽濃縮，最后凍干得限制性凝血酶成品。本發明的有益效果在于：利用豬血制備限制性凝血酶，有利于充分利用豬血資源，減少環境污染；在常溫常壓下即可制備限制性凝血酶，減少設備投資；制備得到的限制性凝血酶純度高，可達到電泳純，可用于酶切GST融合蛋白；操作簡單，僅需離心、上樣層析、超濾和凍干等幾個步驟，容易實現工業化生產。

技術領域

本發明涉及生物工程技術領域，具體地說是一種限制性凝血酶的制備方法。

背景技術

凝血酶(Thrombin,EC3.4.21.5)是血漿凝血系統中的一種具有高度特異性的絲氨酸蛋白水解酶，可作為局部止血藥，是凝血酶凍干粉的主要原料。凝血酶可以水解纖維蛋白原生成纖維蛋白單體，促使血小板分泌和聚集，因此，凝血酶在血液凝固和止血過程中發揮著重要的作用。在臨床上，凝血酶廣泛應用于局部止血，可用于手術中不易結扎的小血管止血，消化道出血以及外傷出血等。凝血酶能識別LeuValProArg↓GlySer氨基酸序列，因此凝血酶在基因工程中所得到的融合蛋白產品的后序加工處理過程中具有獨特的作用，為達到子目的，必須使用限制性的凝血酶。現有技術制備方法一般包括三個基本步驟，即提取、純化和凍干(或制劑)。公開號為CN1844380A的發明專利提出了一種制備高純度凝血酶的方法，該方法利用層析介質吸附低純度凝血酶溶液，對層析柱進行洗脫，收集凝血酶蛋白峰，再經凝膠層析，超濾脫鹽濃縮，最后凍干得限制性凝血酶成品。該專利申請涉及到利用凝膠層析，不容易實現工業化生產，且僅用到比活一個參數，不足以說明凝血酶的純度。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是：提供一種純度高、比活高的限制性凝血酶的制備方法。

為了解決上述技術問題，本發明采用的技術方案為：限制性凝血酶的制備方法，包括如下步驟：

步驟1、向新鮮豬血中加入抗凝劑，離心分離，取上清抗凝血漿；

步驟2、將上清抗凝血漿用陰離子交換柱層析，然后用洗脫劑Ⅰ對陰離子交換柱進行洗脫，所得洗脫液即為凝血酶原溶液；

步驟3、活化凝血酶原溶液中的凝血酶原，得凝血酶粗溶液；

步驟4、將凝血酶粗溶液進行超濾濃縮，得凝血酶濃縮液；

步驟5、將所得的凝血酶濃縮液用陽離子交換柱層析，然后用洗脫劑Ⅱ對陽離子交換柱進行洗脫，收集凝血酶蛋白峰，得初步純化的凝血酶溶液；

步驟6、將步驟5所得凝血酶溶液用平衡液進行透析；

步驟7、將步驟6所得凝血酶溶液用陽離子交換柱層析，然后用洗脫劑Ⅲ對陽離子交換柱進行洗脫，所得洗脫液即為限制性凝血酶溶液；

步驟8、將限制性凝血酶溶液進行超濾脫鹽濃縮，得限制性凝血酶濃縮液；

步驟9、將限制性凝血酶濃縮液凍干，即得白色粉末狀限制性凝血酶成品。

本發明的有益效果在于：利用豬血制備限制性凝血酶，有利于充分利用豬血資源，減少環境污染；在常溫常壓下即可制備限制性凝血酶，減少設備投資；制備得到的限制性凝血酶純度高，可達到電泳純，可用于酶切GST融合蛋白；操作簡單，僅需離心、上樣層析、超濾和凍干等幾個步驟，容易實現工業化生產。

附圖說明

圖1為本發明實施例1限制性凝血酶制備方法的流程圖。

圖2為本發明實施例2限制性凝血酶凍干粉純度檢測SDS-PAGE色譜圖。

具體實施方式