[發明專利]限制性凝血酶的制備方法

有效

• 申請號: 201610107662.8
• 申請日: 2016-02-26
• 公開（公告）號: CN105624134B
• 公開（公告）日: 2019-05-21
• 發明（設計）人: 黃宏寶;黃發燦;鄭登忠;郭曉乾;章麗麗
• 申請（專利權）人: 福建華燦制藥有限公司
• 主分類號: C12N9/74
• 分類號: C12N9/74
• 代理公司: 福州市博深專利事務所(普通合伙) 35214
• 代理人: 林志崢

1.限制性凝血酶的制備方法，其特征在于：包括如下步驟：

步驟1、向新鮮豬血中加入抗凝劑，離心分離，取上清抗凝血漿；

步驟2、將上清抗凝血漿用陰離子交換柱層析，然后用洗脫劑Ⅰ對陰離子交換柱進行洗脫，所得洗脫液即為凝血酶原溶液；

步驟3、活化凝血酶原溶液中的凝血酶原，得凝血酶粗溶液；

步驟4、將凝血酶粗溶液進行超濾濃縮，得凝血酶濃縮液；

步驟5、將所得的凝血酶濃縮液用陽離子交換柱層析，然后用洗脫劑Ⅱ對陽離子交換柱進行洗脫，收集凝血酶蛋白峰，得初步純化的凝血酶溶液；

步驟6、將步驟5所得凝血酶溶液用平衡液進行透析；

步驟7、將步驟6所得凝血酶溶液用陽離子交換柱層析，然后用洗脫劑Ⅲ對陽離子交換柱進行洗脫，所得洗脫液即為限制性凝血酶溶液；

步驟8、將限制性凝血酶溶液進行超濾脫鹽濃縮，得限制性凝血酶濃縮液；

步驟9、將限制性凝血酶濃縮液凍干，即得白色粉末狀限制性凝血酶成品；

所述洗脫劑Ⅱ包括第一基礎液和第一梯度液，所述第一基礎液為pH值5.0～6.0的檸檬酸-磷酸鹽緩沖液，所述第一基礎液中檸檬酸-磷酸鹽濃度為0.01～0.03mol/L；所述第一梯度液為pH值5.0～6.0的含有第一離子增強劑的緩沖液，所述第一梯度液中的緩沖劑檸檬酸-磷酸鹽的濃度0.01～0.03mol/L，所述第一梯度液中第一離子增強劑濃度為0.2～1.0mol/L；

所述洗脫劑Ⅲ包括第二基礎液和第二梯度液，所述第二基礎液為pH值為5.0～6.0的醋酸鈉-醋酸緩沖液，所述第二基礎液中醋酸鈉-醋酸的濃度為0.01～0.03mol/L，所述第二梯度液為pH值5.0～6.0的含有離子增強劑的緩沖液，所述第二梯度液中的緩沖劑乙酸鈉-乙酸的濃度為0.01～0.03mol/L，所述第二梯度液中第二離子增強劑的濃度為0.2～1.0mol/L。

2.根據權利要求1所述的限制性凝血酶的制備方法，其特征在于：所述抗凝劑為檸檬酸三鈉質量分數為3.8％的檸檬酸三鈉溶液，所述抗凝劑與血液的體積比為1∶7～1∶9。

3.根據權利要求1所述的限制性凝血酶的制備方法，其特征在于：所述步驟3具體為：以氯化鈣為活化劑，向凝血酶原溶液中加入氯化鈣溶液，使凝血酶原溶液中所含Ca²⁺的終濃度為0.05～0.15mol/L，在常溫常壓下活化1～3小時得凝血酶粗溶液。

4.根據權利要求1所述的限制性凝血酶的制備方法，其特征在于：所述洗脫劑Ⅰ為pH為7.0、檸檬酸三鈉濃度為0.02mol/L的檸檬酸三鈉溶液。

5.根據權利要求1所述的限制性凝血酶的制備方法，其特征在于：所述平衡液為含有氯化鈉的緩沖液，所述平衡液的pH為5.0～6.0，所述平衡液中的緩沖劑乙酸-乙酸鈉濃度為0.01～0.03mol/L。

6.根據權利要求1所述的限制性凝血酶的制備方法，其特征在于：所述陰離子交換柱為DEAE Sepharose Fast Flow陰離子交換柱。

7.根據權利要求1所述的限制性凝血酶的制備方法，其特征在于：所述陽離子交換柱為DEAE Sephrose CL-6B陽離子交換柱。