[發(fā)明專利]一種提高基因編輯后綿羊胚胎成纖維細胞同源重組修復頻率的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610104796.4
• 申請日: 2016-02-25
• 公開（公告）號: CN105671045B
• 公開（公告）日: 2018-11-13
• 發(fā)明（設計）人: 皮文輝;周平;郭延華;王偉;黃蘭蘭;韓猛立;簡子健;王新華;劉守仁
• 申請（專利權）人: 新疆農墾科學院
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/85;C12N15/87
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢;白艷

本發(fā)明公開了一種提高基因編輯后綿羊胚胎成纖維細胞同源重組修復頻率的方法。本發(fā)明提供了抑制含有基因編輯DNA片段的離體綿羊胚胎成纖維細胞中Lig4基因表達的物質在制備促進含有基因編輯DNA片段的離體綿羊胚胎成纖維細胞同源重組修復產品中的應用。本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明篩選到抑制綿羊Lig4基因表達的siRNA，通過siRNA抑制綿羊Lig4基因表達,抑制綿羊胚胎成纖維細胞的NHEJ修復途徑從而刺激細胞內HR修復途徑，提高了細胞采用HR修復的頻率，為提高綿羊胚胎成纖維細胞基因打靶效率和研究綿羊基因組精確編輯提供基礎。

技術領域

本發(fā)明涉及生物技術領域，尤其涉及一種提高基因編輯后綿羊胚胎成纖維細胞同源重組修復頻率的方法。

背景技術

利用人工核酸內切酶(Engineered endonuclease,EEN)，如鋅指酶(Zinc fingernucleases，ZFNs)、類轉錄激活因子效應物核酸酶(Transcription activator-likeeffector nucleases,TALENs)和CRISPR/Cas9(Clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats(CRISPR)/CRISPR-associated 9(Cas9))，定點切割基因組，產生特定位點基因組雙鏈斷裂(Double-strand brakes,DSBs)或缺克(Nicks)，促進精確編輯哺乳動物基因組的研究。

細胞主要通過非同源末端連接途徑(Non-homologous end joining,NHEJ)修復DSBs，產生基因敲除表型。共同轉染EEN和單鏈寡核苷酸，或同源序列的供體模板，通過依賴同源模板修復途徑，如微同源臂介導連接(Microhomology-mediated end joining,MMEJ)和同源重組(Homologous recombination,HR)，精確地將外源目的基因敲入細胞基因組，實現基因編輯。即使采用高效的CRISPR/Cas9系統產生基因組的DSBs，細胞選擇NHEJ修復事件的發(fā)生概率超過90％，利用同源模板的修復概率低于10％。說明多數細胞中，NHEJ遠遠超過依賴同源模板修復事件的發(fā)生概率。

抑制NHEJ途徑，促使細胞采用HR修復途徑，能夠提高HR修復頻率。用EEN定點斷裂果蠅細胞基因組，RNA干擾(RNA inhibite,RNAi)瞬時抑制Lig4基因(DNA Ligase 4,Lig4)翻譯，PCR擴增短的左右同源臂(80和60nt)供體模板，在藥物篩選的細胞中，同源重組效率達50％。EEN處理Lig4-/-突變體的果蠅胚胎、擬南芥，與野生型比較，同源重組效率顯著提高。調控抑制線蟲(Caenorhabditis elegans)體細胞中的Lig4蛋白因子，從而抑制NHEJ，使有機體修復DSBs途徑轉向MMEJ。Bmku70蛋白是NHEJ的必須因子，敲除Bmku70基因的家蠶胚胎，顯微注射CRISPR/Cas9系統質粒和供體模板，與野生型家蠶胚胎比較，HR效率更高。SCR7(5,6-bis(benzylideneamino)-2-mercapto-pyrimidin-4-ol)特異性同人類Lig4蛋白的DNA結合域(DNA binding domain,DBD)結合，阻斷了Lig4與DNA結合，抑制NHEJ修復途徑，提高HR修復頻率4-5倍。

Lig4敲除的果蠅能夠正常生存，但小鼠Lig4基因敲除表現為胚胎致死，至今對哺乳動物Lig4基因敲除的研究較少。哺乳動物細胞修復DSBs的3條主要途徑：NHEJ、MMEJ和HR，呈現互補競爭關系，抑制NHEJ將刺激細胞選用HR修復途徑。

Gorbunova實驗室定量研究NHEJ和HR修復途徑，獲得細胞老齡化狀態(tài)不同，對基因組DSBs修復結果不同；人類體細胞修復DSBs，主要采用NHEJ途徑，而且在細胞周期各個階段都可以使用NHEJ；HR修復主要發(fā)生在S期。

基因打靶技術以同源重組為基礎，是一種定向改變生物活體遺傳信息的實驗手段，促進了生物學研究。正常哺乳動物細胞發(fā)生同源重組概率極低，造成基因打靶效率極低(10^-6)。