[發明專利]基于適體的靶向激活循環放大SPR檢測蛋白質的方法

在審

• 申請號: 201610104662.2
• 申請日: 2016-02-25
• 公開（公告）號: CN105648069A
• 公開（公告）日: 2016-06-08
• 發明（設計）人: 何鵬;隋永鹍;喬文蘋;張書圣
• 申請（專利權）人: 青島科技大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;G01N33/68;G01N33/553
• 代理公司: 濟南圣達知識產權代理有限公司 37221
• 代理人: 曹麗

1.一種基于適體的靶向激活循環放大SPR檢測蛋白質的方法，其特征是：步驟如下：

(1)基底上發夾結構的檢測探針DNAS1既含有靶蛋白的適體序列，又具有剪切酶的識 別序列，當待測系統中具有靶蛋白時，靶蛋白與DNAS1上的適體序列部分特異性結合，使 發夾結構的檢測探針被打開，發夾結構的檢測探針DNAS1上3’暴露出來；

(2)納米金生物條碼探針上組裝了兩種DNA分子，分別是捕獲量子點信號探針的捕獲 鏈DNAS3和能夠與打開的發夾結構探針雜交互補，充當聚合反應引物的DNAS2，所述DNA S2與步驟(1)打開的發夾探針互補雜交后，以發夾探針為模板鏈復制，將靶蛋白質從DNA S1上替換下來，替換下來的靶蛋白與其他的發夾探針結合，引發新的靶分子的替換聚合反應， 同時，由于發夾結構的檢測探針上還具有剪切酶的識別序列，當引物沿模板鏈聚合生長形成 雙鏈結構時，在內切酶的作用下，在雙鏈的識別位點處在模板鏈對應的互補序列上形成缺口， 隨后再在DNA聚合酶的作用下，引物鏈從缺口處繼續沿模板鏈聚合生長，將形成缺口的另 一段單鏈替換下來，釋放出的單鏈DNA由于具有較多與模板鏈互補的序列，也能和其他的 發夾探針互補雜交，將發夾打開，從而引發新的核酸鏈替代聚合反應，結合靶分子的替換聚 合循環放大，形成了雙重循環放大體系；

(3)將步驟(2)反應結束后得到的基底進行表面等離子共振檢測。

2.如權利要求1所述的方法，其特征是：所述步驟(1)中待測系統中的PBS緩沖溶液的 pH為6.5-8.5，更優選7.4。

3.如權利要求1所述的方法，其特征是：所述步驟(2)中雙重循環放大反應的反應溫度 為20-50℃，更優選37℃；反應的時間為10-150min，更優選90min。

4.如權利要求1所述的方法，其特征是：所述步驟(1)發夾結構探針的濃度為5.0×10^-8M-1.0×10^-5M，更優選5.0×10^-7M。

5.如權利要求1所述的方法，其特征是：所述步驟(2)納米金生物條碼探針上S3/S2為 1:1-50:1，更優選20:1。

6.如權利要求1所述的方法，其特征是：所述步驟(2)中DNA聚合酶的用量為0.05U μL^-1-0.5UμL^-1，更優選DNA聚合酶的用量為0.3UμL^-1。

7.如權利要求1所述的方法，其特征是：所述步驟(2)內切酶的用量為0.05UμL^-1-0.5U μL^-1，切刻內切酶的用量為0.3UμL^-1。

8.如權利要求1所述的方法，其特征是：所述步驟(3)具體為：將基底固定在SPR檢 測儀上，通入DNA功能化的量子點信號探針，進行表面等離子共振檢測，所述量子點信號 探針上固定的DNAS4能夠與雙重循環放大反應的產物互補雜交，增強檢測信號。

9.如權利要求1所述的方法，其特征是：所述靶蛋白為溶菌酶。

10.一種利用表面等離子共振檢測蛋白質的試劑盒，其特征是：基底上發夾結構的檢測探 針、納米金生物條碼探針，所述基底上發夾結構的檢測探針既含有靶蛋白的適體序列DNAS1， 又具有剪切酶的識別序列，當待測系統中具有靶蛋白時，靶蛋白與發夾結構的檢測探針DNA S1上的適體序列部分特異性結合，使發夾結構的檢測探針被打開，發夾結構的檢測探針DNA S1上的3’端的莖部3’暴露出來，所述納米金生物條碼探針上組裝了兩種DNA分子，分別是 捕獲量子點信號探針的捕獲鏈DNAS3和能夠與打開的發夾結構探針雜交互補并充當聚合反 應前體的DNAS2，核酸鏈替代聚合反應體系和靶分子替代聚合反應體系。