[發明專利]基于適體的靶向激活循環放大SPR檢測蛋白質的方法

在審

• 申請號: 201610104662.2
• 申請日: 2016-02-25
• 公開（公告）號: CN105648069A
• 公開（公告）日: 2016-06-08
• 發明（設計）人: 何鵬;隋永鹍;喬文蘋;張書圣
• 申請（專利權）人: 青島科技大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;G01N33/68;G01N33/553
• 代理公司: 濟南圣達知識產權代理有限公司 37221
• 代理人: 曹麗

技術領域

本發明涉及一種基于適體的靶向激活循環放大SPR檢測蛋白質的方法。

背景技術

核酸適體是人工合成的，利用SELEX技術篩選出來的能夠與目標分子特異性識別和高親 和力結合的DNA和RNA單鏈寡核苷酸。與未修飾的RNA組成的適體容易被血清中的核糖 核酸酶消化相比，DNA適體與靶分子的結合活性具有較寬的適用范圍。除此之外，與傳統的 抗體技術相比，適體在合成，標記，傳遞信號，放大等方面展現的獨特的優越性使其在生物 檢測分析中得到廣泛的應用。

迄今為止，基于適體的生物分析在生命科學和工業分析領域已經得到廣泛的關注。一些 研究小組利用適體與靶分子結合產生的構象轉變作為切入點設計了新型的檢測探針和信號檢 測機理用于光學和電化學分析系統中。然而，由于適體與其靶分子之間相對較低的結合常數， 利用傳統的轉換機理難以設計高靈敏的檢測探針。因此，對于基于適體技術的生物傳感系統， 研制相應的信號放大機理來進一步提高檢測靈敏度是至關重要的。

在DNA循環放大技術中，鏈替代聚合反應(strand-displacementpolymerization，SDP)， 作為一種等溫核酸循環放大技術在適體分析系統中已經引起了高度的注意。在這一循環體系 中，在靶分析物的作用下，引物能夠與模板鏈互補雜交，隨后利用聚合酶的作用，引物在模 板鏈上發生聚合生長反應，將靶分析物從模板鏈上替換下來，釋放出的靶分析物又會引發循 環的放大過程，從而不斷的放大靶分析物的識別綁定單元。在鏈替代聚合為基礎的適體傳感 分析系統中包含兩種反應機理：核酸鏈替代聚合反應(nucleicacid strand-displacementpolymerization，NDP)和靶分子替代聚合反應(targetmolecule-displacement polymerization，TDP)。在NDP反應中，核酸鏈能夠通過循環的聚合反應替換下來，而在TDP 反應中，發生循環替代反應的是靶分子，如蛋白質、小分子等。

溶菌酶是生物體內普遍存在的一種蛋白質，它能夠催化細菌多糖壁上的乙縮醛基團的裂 解。在正常的生理條件下，人體組織和分泌物中的溶菌酶濃度較低。而據文獻報道，血清、 尿液和細胞中溶菌酶濃度的改變與白血病、腎臟疾病及腦膜炎等疾病具有密切的聯系。因此， 溶菌酶的特異性識別和高靈敏檢測在基礎研究及臨床醫學中具有重要的意義。

發明內容

本發明的目的就是為了解決上述問題，提供一種基于適體的靶向激活循環放大SPR檢測 蛋白質的方法。

為了實現上述目的，本發明采用如下技術方案：

一種基于適體的靶向激活循環放大SPR檢測蛋白質的方法，步驟如下：

(1)基底上發夾結構的檢測探針DNAS1既含有靶蛋白的適體序列，又具有剪切酶的識 別序列，當待測系統中具有靶蛋白時，靶蛋白與DNAS1上的適體序列部分特異性結合，使 發夾結構的檢測探針被打開，發夾結構的檢測探針DNAS1上3’端的莖部暴露出來；

(2)納米金生物條碼探針上組裝了兩種DNA分子，分別是捕獲量子點信號探針的捕獲 鏈DNAS3和能夠與打開的發夾結構探針雜交互補并充當聚合反應引物的DNAS2，所述DNA S2與步驟(1)打開的發夾探針互補雜交后，以發夾探針為模板鏈復制，將靶蛋白質從DNA S1上替換下來，替換下來的靶蛋白與其他的發夾探針結合，引發新的靶分子的替換聚合反應， 同時，由于發夾結構的檢測探針上還具有剪切酶的識別序列，當引物沿模板鏈聚合生長形成 雙鏈結構時，在內切酶的作用下，在雙鏈的識別位點處在模板鏈對應的互補序列上形成缺口， 隨后再在DNA聚合酶的作用下，引物鏈從缺口處繼續沿模板鏈聚合生長，將形成缺口的另 一段單鏈替換下來，釋放出的單鏈DNA由于具有較多與模板鏈互補的序列，也能和其他的 發夾探針互補雜交，將發夾打開，從而引發新的核酸鏈替代聚合反應，結合靶分子的替換聚 合循環放大，形成了雙重循環放大體系；

(3)將步驟(2)反應結束后得到的基底進行表面等離子共振檢測。

優選：所述步驟(1)中待測系統中的PBS緩沖溶液的pH為6.5-8.5，更優選7.4。

所述步驟(2)中雙重循環放大反應的反應溫度為20-50℃，更優選37℃；反應的時間為 10-150min，更優選90min。