[發(fā)明專利]一種啟動(dòng)子批量捕獲方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610103879.1
• 申請(qǐng)日: 2016-02-25
• 公開（公告）號(hào): CN107091929B
• 公開（公告）日: 2019-08-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 楊劍波;王常霖;魏鵬程;李娟;李浩;楊亞春;李莉;許蓉芳
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所
• 主分類號(hào): C12Q1/6869
• 分類號(hào): C12Q1/6869;G01N33/68
• 代理公司: 北京律譜知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11457
• 代理人: 黃云鐸

本發(fā)明提供一種啟動(dòng)子批量捕獲方法，所述方法利用植物基因轉(zhuǎn)錄時(shí)在啟動(dòng)子區(qū)域所形成的“DNA?蛋白因子”的復(fù)合體，應(yīng)用改進(jìn)的染色體免疫共沉淀技術(shù)，把包含有未知植物基因啟動(dòng)子片段的DNA分揀出來(lái)。本發(fā)明利用蛋白因子OsTBP2和OsTFIIB緊密結(jié)合啟動(dòng)子上的TATA盒短鏈保守序列啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄這一特性，通過(guò)生成這兩種因子的特異性抗體，結(jié)合染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)(ChIP)，專向捕捉未知植物基因啟動(dòng)子片段的技術(shù)。本技術(shù)利用大多數(shù)啟動(dòng)子都含有的一段TATA盒短鏈保守序列這一特點(diǎn)，結(jié)合近年來(lái)新開發(fā)的染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)(ChIP)來(lái)分離未知的植物基因啟動(dòng)子片段的技術(shù)，比較容易實(shí)現(xiàn)植物啟動(dòng)子的大規(guī)模捕獲，具有較高的商業(yè)價(jià)值。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及到生物技術(shù)和植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及一種能夠批量地從植物中捕獲啟動(dòng)子的方法，該方法利用植物基因轉(zhuǎn)錄時(shí)在啟動(dòng)子區(qū)域所形成的“DNA-蛋白因子”的復(fù)合體，通過(guò)改進(jìn)的染色體免疫共沉淀技術(shù)，使用復(fù)合體中蛋白因子的特異性抗體，從植物基因組分離未知的基因啟動(dòng)子片段。

背景技術(shù)

在植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，基因的調(diào)控序列即啟動(dòng)子對(duì)植物在不同的生長(zhǎng)階段里特定組織結(jié)構(gòu)的形成和生長(zhǎng)發(fā)育，以及對(duì)外界生物、非生物因子的脅迫應(yīng)答都起著決定性的作用。啟動(dòng)子區(qū)域中的保守序列是轉(zhuǎn)錄因子的靶標(biāo)，兩者的特異結(jié)合是促進(jìn)下游編碼基因表達(dá)的重要環(huán)節(jié)，因此研究特定基因的調(diào)控首先要了解它的啟動(dòng)子。

大多數(shù)啟動(dòng)子都含有一些短鏈的保守序列，也叫做順式作用元件。啟動(dòng)子上的TATA box，是許多通用轉(zhuǎn)錄因子的裝配位點(diǎn)。TFIID因子對(duì)TATA box的識(shí)別是轉(zhuǎn)錄起始的第一步，轉(zhuǎn)錄因子TFIID的亞基TBP(TATA-binding protein)特異性識(shí)別和結(jié)合TATA box，然后促進(jìn)其他轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，從而形成多因子的全酶-RNA聚合酶II。轉(zhuǎn)錄因子TFIIB是TFIID和RNA聚合酶的橋梁因子，能夠富集高濃度的RNA聚合酶到啟動(dòng)子的周圍，轉(zhuǎn)錄因子TFIID與TATA box結(jié)合后，轉(zhuǎn)錄因子TFIIB不對(duì)稱的結(jié)合于TATA box的下游，決定轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，并保護(hù)起始位點(diǎn)附近的DNA模板鏈。同樣地，在植物基因轉(zhuǎn)錄過(guò)程中，RNA聚合酶和一些轉(zhuǎn)錄因子，通過(guò)一系列復(fù)雜過(guò)程識(shí)別并結(jié)合到啟動(dòng)子區(qū)域中的保守序列上，組成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物，由此推動(dòng)目的基因以適當(dāng)?shù)膹?qiáng)度，在特定的時(shí)間和空間表達(dá)基因產(chǎn)物。

自從進(jìn)入21世紀(jì)以來(lái)，基因組的研究取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步，基因數(shù)據(jù)庫(kù)信息不斷豐富，促進(jìn)了功能基因和啟動(dòng)子的研究的發(fā)掘。然而相對(duì)于其它生物，對(duì)植物的基因發(fā)掘，在數(shù)量和質(zhì)量方面還相當(dāng)有限，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足作物分子育種的需求。尤其是對(duì)啟動(dòng)子的研究和發(fā)掘，大都基于對(duì)個(gè)別基因的分析認(rèn)識(shí)，分離和表達(dá)等，難以做到規(guī)模化和系統(tǒng)化的開發(fā)。

現(xiàn)有技術(shù)中也存在著一些尋找植物基因中的啟動(dòng)子的方法，但是，現(xiàn)有技術(shù)中的方法往往是通過(guò)軟件測(cè)算的估計(jì)啟動(dòng)子的可能存在，并不能直接一次性獲得大量的啟動(dòng)子。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)上述問(wèn)題，本發(fā)明希望提供一種能夠批量捕獲植物中各種未知啟動(dòng)子的方法。

本發(fā)明的目的是提供一種隨機(jī)分離植物基因啟動(dòng)子片段的有效技術(shù)方法。

具體而言，本發(fā)明開發(fā)了水稻基因轉(zhuǎn)錄裝置中的RNA聚合酶II型(Pol II)里面的DNA結(jié)合蛋白OsTBP2抗體和它的增強(qiáng)子OsTFIIB抗體。所述抗體能夠有效結(jié)合到水稻基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控位點(diǎn)TATA盒上。通過(guò)多聚甲醛對(duì)活體水稻幼苗的固定，用超聲波對(duì)植物細(xì)胞的破碎，使用染色體免疫共沉淀手段，把DNA結(jié)合蛋白和含有TATA盒序列的啟動(dòng)子片段分揀出來(lái)。由于大部分的啟動(dòng)子都含有TATA盒序列，可以在分揀的DNA中獲得多個(gè)啟動(dòng)子。然后克隆出分揀的啟動(dòng)子，在植物體內(nèi)進(jìn)行功能驗(yàn)證。本發(fā)明改變了常規(guī)手段對(duì)單個(gè)啟動(dòng)子的分離和獲取。

植物基因啟動(dòng)子的高效獲取手段通過(guò)如下方法實(shí)施：

所述OsTBP2和OsTFIIB抗體在ChIP新技術(shù)應(yīng)用中，采取以下方案實(shí)施：