[發明專利]一種啟動子批量捕獲方法

有效

• 申請號: 201610103879.1
• 申請日: 2016-02-25
• 公開（公告）號: CN107091929B
• 公開（公告）日: 2019-08-02
• 發明（設計）人: 楊劍波;王常霖;魏鵬程;李娟;李浩;楊亞春;李莉;許蓉芳
• 申請（專利權）人: 安徽省農業科學院水稻研究所
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869;G01N33/68
• 代理公司: 北京律譜知識產權代理事務所(普通合伙) 11457
• 代理人: 黃云鐸

1.一種啟動子批量捕獲方法，其特征在于，所述方法利用植物基因轉錄時在啟動子區域所形成的“DNA-蛋白因子”的復合體，應用改進的染色體免疫共沉淀技術ChIP，把包含有未知植物基因啟動子片段的DNA分揀出來，實現啟動子片段的有效富集，所述方法包括下述步驟：

1)取預定量水稻材料，對水稻材料中的植物細胞進行交聯；

2)對所述植物細胞進行粉碎；

3)對所得產物進行離心沉積，獲得含有“DNA-蛋白因子”復合體的清液，所述蛋白因子包括OsTBP2及增強OsTBP2與TATA盒結合的OsTFIIB蛋白；

4)制備用于克隆OsTBP2和OsTFIIB的引物；以水稻品種日本晴的cDNA序列為模板，利用所述引物，用DNA聚合酶對OsTBP2和OsTFIIB的編碼序列進行擴增，并且將該擴增片段鏈接在TA載體Invitrogen上，將鏈接有基因片段的載體轉化到大腸桿菌XL-Blue感受態細胞中，實現基因的克隆；將正確克隆的基因片段再引入到pET30a載體上，隨后轉化進入大腸桿菌BL2(DE3)感受態細胞中，通過1mM異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)的誘導表達，獲得OsTBP2和OsTFIIB的重組蛋白；利用OsTBP2和OsTFIIB重組蛋白生產相應抗體，對所獲得的抗體進行親和純化，將含有“DNA-蛋白因子”復合體的清液與所述蛋白因子的蛋白因子抗體接觸，使所述蛋白因子與蛋白因子抗體相結合形成目標蛋白核酸結合體，用磁珠蛋白A收集結合有抗體的復合體，然后用10mg/ml蛋白酶K降解結合蛋白，釋放出含有TATA盒的DNA片段；用水稻pal基因啟動子作為模板通過半定量PCR來檢測釋放出的DNA片段中TATA盒的存在；

5)收集所述目標蛋白核酸結合體并對所述目標蛋白核酸結合體進行酶解，除去所述蛋白因子抗體；

6)從酶解產物中提取出所述DNA碎片；

7)對上述釋放出的DNA片段進行測序和生物信息學比對，初步確定啟動子片段的富集程度；

8)通過實驗驗證富集的啟動子片段的功能，以及在其基礎上進行啟動子優化設計，

其中，所述步驟1)包括：采用1％多聚甲醛溶液對生長10天左右的水稻幼苗進行固定，用超聲波細胞破碎儀對幼苗提取液作破碎處理，交聯植物細胞；所述步驟2)包括：對待提取植株材料進行超聲粉碎；

所述步驟7)包括對所獲得的DNA碎片進行定量或半定量PCR擴增；對所獲得的DNA片段進行Chip-seq測序，通過對測序結果的生物學分析，篩選出其中可能的啟動子片段；

步驟8)包括：從水稻基因組中克隆出啟動子片段，構建啟動子與報告基因的融合表達載體，在煙草中進行瞬時轉化或水稻中的穩定遺傳轉化，通過檢測報告基因的表達模式，進一步確定分離的啟動子的功能。