[發(fā)明專利]瓊脂包埋果蠅的透射電鏡制樣方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610103594.8
• 申請日: 2016-02-25
• 公開（公告）號: CN105699145A
• 公開（公告）日: 2016-06-22
• 發(fā)明（設計）人: 孟春梅;莫肖敏;李衛(wèi)東;黃遠潔;鄭華;成曉靜
• 申請（專利權(quán)）人: 廣西醫(yī)科大學
• 主分類號: G01N1/28
• 分類號: G01N1/28
• 代理公司: 廣西南寧公平專利事務所有限責任公司 45104
• 代理人: 王素娥

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于細胞生物學領(lǐng)域，具體是瓊脂包埋果蠅的透射電鏡制樣方法。

背景技術(shù)

目前對于具有角質(zhì)層，厚壁等戊二醛不易穿透的透射電鏡樣本，一般采取 使用4％多聚甲醛(或2％多聚甲醛)-2.5％戊二醛混合固定液代替單一的戊二醛 固定液，或在戊二醛溶液里添加TritonX-100提高固定液的穿透力，所以制 備果蠅樣本時，是直接將果蠅丟入固定液中進行處理。包埋劑包埋時常使用膠 囊、離心管或離心管式的包埋管，包埋時將果蠅背部貼在膠囊底部或離心管管 底，但聚合完后會發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)果蠅都已飄在樹脂塊的中間或表面，即我們需 要的目標位置——背部變動了。多數(shù)包埋劑在聚合時需要60℃、70℃的高溫， 在此高溫下，管內(nèi)的空氣不斷地往外排出，由于果蠅體輕，會在空氣的帶動下 移動。針對此種情況，目前常用的有兩種解決辦法，一是轉(zhuǎn)動切片機上玻璃刀 的角度，使刀口與果蠅背部平行，這樣不便于修面和超薄切片，還給超薄切片 時使用的鉆石刀埋下安全隱患；二是將樣本從樹脂塊上割下來，重新調(diào)整位置 進行二次或三次包埋，這要用到小型不銹鋼鋸條，比較費力。只處理一兩個這 樣的樣本相對容易些，但每個實驗組都有幾個重復，兩種處理方法顯然都費時 費力、效率低。

目前對于果蠅背部肌肉的取向定位還尚缺簡單、快速實用的方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種瓊脂包埋果蠅的透射電鏡制樣方法。

本發(fā)明的解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案如下：

瓊脂包埋果蠅的透射電鏡制樣方法，是將果蠅用瓊脂溶液預包埋后制備透 射電鏡樣本以實現(xiàn)快速定位果蠅背部肌肉的方法，操作步驟如下：

1.果蠅經(jīng)乙醚熏暈后取出，用雙面刀片快速將頭切下(勿人為撕斷下頭 部)，立即將果蠅丟入體積分數(shù)為3％的戊二醛固定液中，抽真空使其沉入管底， 在4℃條件下固定2小時。

2.提前配好質(zhì)量分數(shù)為2％的瓊脂粉溶液，放入4℃冰箱保存，用時微波爐 加熱溶解，溫度降至不燙手時待用。取出一個載玻片，用鑷子輕輕夾出步驟1 固定液中的果蠅，放在載玻片上，調(diào)整方向為側(cè)躺狀態(tài)，在果蠅上滴兩三滴瓊 脂溶液，待瓊脂凝固后用雙面刀片修整，根據(jù)果蠅身體將瓊脂塊修成長方體， 長方體大小為果蠅體積的三倍，果蠅背部貼在長方體最小面積的一個面上，且 與之平行，果蠅背部與長方體瓊脂塊最小面的距離為0～5毫米。

3.將步驟2瓊脂包埋好的果蠅依次經(jīng)過0.1mol/L磷酸緩沖液清洗3次， 每次清洗10分鐘；用質(zhì)量分數(shù)為1％的鋨酸固定2小時；用體積分數(shù)為50％、 70％、90％的乙醇梯度脫水，各1次，時間各為10分鐘；用體積分數(shù)90％的乙 醇與體積分數(shù)90％的丙酮體積比1:1脫水10分鐘；用純丙酮脫水3次，時間 各為10分鐘；用環(huán)氧樹脂618包埋劑與純丙酮體積比1:1滲透1小時，用環(huán) 氧樹脂618包埋劑與純丙酮體積比3:1滲透3小時；用純包埋劑滲透過夜；純 包埋劑包埋，包埋時，將果蠅背部所平行的一面頂在包埋板模塊的頂端，即果 蠅背部與包埋板模塊的頂端面平行；在聚合箱內(nèi)36℃條件下滲透24小時，45℃ 條件下聚合12小時，65℃條件下聚合48h得到瓊脂包埋果蠅的透射電鏡包埋 塊。

所述包埋劑：

環(huán)氧樹脂618包埋劑配方：

聚合條件：在36℃條件下滲透12～24小時，在45℃條件下聚合12～48 小時，在65℃條件下聚合24～48小時。

Epon-812包埋劑配方：

聚合條件：在60℃條件下聚合24小時。

Spurr樹脂包埋劑配方：

聚合條件：在70℃條件下聚合12小時。

4.從步驟3得到瓊脂包埋果蠅的透射電鏡包埋塊，我們發(fā)現(xiàn)果蠅的位置跟 樹脂包埋時擺放的位置一致，即背部緊貼在包埋塊頂端或與頂端平行。切片機 切出2μm厚度的半薄切片，在潔凈的載玻片上滴一滴雙蒸水，用鑷子小心地 將半薄切片夾到水滴上，置于電加熱板上加熱烤干，再滴上一滴質(zhì)量分數(shù)為 1％的甲苯胺藍染液，染色30秒，雙蒸水沖洗，電加熱板上烤干，顯微鏡下觀 察，獲得果蠅背部肌肉的縱向切面，完成定位，為該縱向肌肉位置的超薄切片 做好準備。