[發明專利]瓊脂包埋果蠅的透射電鏡制樣方法

在審

• 申請號: 201610103594.8
• 申請日: 2016-02-25
• 公開（公告）號: CN105699145A
• 公開（公告）日: 2016-06-22
• 發明（設計）人: 孟春梅;莫肖敏;李衛東;黃遠潔;鄭華;成曉靜
• 申請（專利權）人: 廣西醫科大學
• 主分類號: G01N1/28
• 分類號: G01N1/28
• 代理公司: 廣西南寧公平專利事務所有限責任公司 45104
• 代理人: 王素娥

1.瓊脂包埋果蠅的透射電鏡制樣方法，是將果蠅用瓊脂溶液預包埋后制備 透射電鏡樣本以實現快速定位果蠅背部肌肉的方法，其特征在于：操作步驟如 下：

(1)果蠅經乙醚熏暈后取出，用雙面刀片快速將頭切下(勿人為撕斷下 頭部)，立即將果蠅丟入體積分數為3％的戊二醛固定液中，抽真空使其沉入管 底，在4℃條件下固定2小時；

(2)提前配好質量分數為2％的瓊脂粉溶液，放入4℃冰箱保存，用時微 波爐加熱溶解，溫度降至不燙手時待用，取出一個載玻片，用鑷子輕輕夾出步 驟(1)固定液中的果蠅，放在載玻片上，調整方向為側躺狀態，在果蠅上滴 兩三滴瓊脂溶液，待瓊脂凝固后用雙面刀片修整，根據果蠅身體將瓊脂塊修成 長方體，長方體大小為果蠅體積的三倍，果蠅背部貼在長方體最小面積的一個 面上，且與之平行，果蠅背部與長方體瓊脂塊最小面的距離為0～5毫米；

(3)將步驟(2)瓊脂包埋好的果蠅依次經過0.1mol/L磷酸緩沖液清洗 3次，每次清洗10分鐘；用質量分數為1％的鋨酸固定2小時；用體積分數為 50％、70％、90％的乙醇梯度脫水，各1次，時間各為10分鐘；用體積分數90％ 的乙醇與體積分數90％的丙酮體積比1:1脫水10分鐘；用純丙酮脫水3次， 時間各為10分鐘；用環氧樹脂618包埋劑與純丙酮體積比1:1滲透1小時， 用環氧樹脂618包埋劑與純丙酮體積比3:1滲透3小時；用純包埋劑滲透過夜； 純包埋劑包埋，包埋時，將果蠅背部所平行的一面頂在包埋板模塊的頂端，即 果蠅背部與包埋板模塊的頂端面平行；在聚合箱內36℃條件下滲透24小時， 45℃條件下聚合12小時，65℃條件下聚合48小時得到瓊脂包埋果蠅的透射電 鏡包埋塊；

所述包埋劑：

環氧樹脂618包埋劑配方：

聚合條件：在36℃條件下滲透12～24小時，在45℃條件下聚合12～48 小時，在65℃條件下聚合24～48小時；

Epon-812包埋劑配方：

聚合條件：在60℃條件下聚合24小時；

Spurr樹脂包埋劑配方：

聚合條件：在70℃條件下聚合12小時；

(4)從步驟(3)得到瓊脂包埋果蠅的透射電鏡包埋塊，我們發現果蠅的 位置跟樹脂包埋時擺放的位置一致，即背部緊貼在包埋塊頂端或與頂端平行。 切片機切出2μm厚度的半薄切片，在潔凈的載玻片上滴一滴雙蒸水，用鑷子 小心地將半薄切片夾到水滴上，置于電加熱板上加熱烤干，再滴上一滴質量分 數為1％的甲苯胺藍染液，染色30秒，雙蒸水沖洗，電加熱板上烤干，顯微鏡 下觀察，獲得果蠅背部肌肉的縱向切面，完成定位，為該縱向肌肉位置的超薄 切片做好準備。