[發明專利]以市售的酸性木聚糖酶制備煙草加工的輔助酶制劑及應用

在審

• 申請號: 201610103303.5
• 申請日: 2016-02-25
• 公開（公告）號: CN105647889A
• 公開（公告）日: 2016-06-08
• 發明（設計）人: 韓偉;黃文榮;劉士清;張無敵;尹芳;陳應昆;何寶玉;趙春雷;雷宇;王金浩;王應中;韓夢璇;趙剛
• 申請（專利權）人: 云南萬芳生物技術有限公司
• 主分類號: C12N9/42
• 分類號: C12N9/42;A24B15/30;A24B15/20
• 代理公司: 昆明科陽知識產權代理事務所 53111
• 代理人: 孫山明

1.以市售的酸性木聚糖酶制備煙草加工的輔助酶制劑，其特征是：該制劑酸性木聚糖酶的酶活力在50℃和pH4.5下為3000～4000U/mL。

2.根據權利要求1所述的酶制劑，其特征是：該制劑酸性木聚糖酶的最佳酶活力為3500U/mL。

3.制備如權利要求1～2之一種所述的以酸性木聚糖酶作為煙草加工輔助添加的酶制劑的方法，包括以下步驟：

（1）用pH4.5緩沖液溶解蛋白酶活性抑制劑PMSF，PMSF在緩沖液中的濃度為0.01mol/L，再按緩沖液與水的體積比1：4稀釋緩沖液；將市售的酸性木聚糖酶固體物酶源與稀釋緩沖液該兩者按重量體積比1g：10～20mL混勻得混合液，加入NaCl攪拌溶解，混合液與NaCl的重量體積比為0.75g/L；過濾，收集濾液作為待精制處理的粗酶液，靜置；

上述緩沖液為Britton-Robinsion緩沖液；

上述在市售的酸性木聚糖酶固體物酶源中加入pH4.5的稀釋緩沖液的量與酶源的原始酶活力呈正相關；

（2）在步驟（1）靜置1h的粗酶液中加入(NH₄)₂SO₄，(NH₄)₂SO₄濃度為25％，緩慢攪拌溶解，靜置2h；繼續加入(NH₄)₂SO₄濃度至80%，靜置過夜，離心得到第一次沉淀；所得上清液則補加10%的(NH₄)₂SO₄靜置過夜后，再離心得第二次沉淀，合并以上兩次沉淀；

所述(NH₄)₂SO₄濃度為重量體積比；

（3）配制濃度為0.1%的EDTA溶液，該溶液與沉淀的體積比為1：2；

將步驟（2）收集的沉淀與pH4.5的稀釋緩沖液按體積比2：1混勻后加入以上EDTA溶液，靜置，離心，得到去除金屬離子的酶上清液；

（4）往酶上清液加入濃度為0.01%的蔗糖低聚物，酶上清液與蔗糖低聚物的體積比為100︰1，作為初制品，-8℃冷凍干燥濃縮至初制品的1/8～1/10倍，得酶活力為3000～4000U/mL濃縮的酸性木聚糖酶制劑，其中，濃縮的酸性木聚糖酶制劑的最佳酶活力為3500U/mL；

所述蔗糖低聚物濃度為重量體積比。

4.根據權利要求3所述的酶制劑制備方法，其特征是：所述步驟（1）pH4.5的稀釋緩沖液中加有Ca(NO₃)₂、MgSO₄、ZnSO₄和FeSO₄，其中，Ca(NO₃)₂、MgSO₄、ZnSO₄和FeSO₄分別與緩沖液的重量體積比為0.3g/100mL，以恢復酶制劑的酸性木聚糖酶酶活力，及在50℃下所測定的酶活力。

5.根據權利要求3或4所述的酶制劑制備方法，其特征是：步驟（1）酶源的原始酶活力5，000U/g，酸性木聚糖酶固體物與pH4.5的稀釋緩沖液該兩者按重量體積比1g：10mL：酶源的原始酶活力10，000U/g，酸性木聚糖酶固體物與pH4.5的稀釋緩沖液該兩者按重量體積比1g：20mL。

6.根據權利要求3或4所述的酶制劑制備方法，其特征是：步驟（4）以濃度為0.01%的β-環糊精替代蔗糖低聚物，酶上清液與β-環糊精的體積比為100︰1，作為初制品，-8℃冷凍干燥濃縮至初制品的1/8～1/10倍，得酶活力為3000～4000U/mL濃縮的酸性木聚糖酶制劑。

7.根據權利要求5所述的酶制劑制備方法，其特征是：步驟（4）以濃度為0.01%的β-環糊精替代蔗糖低聚物，酶上清液與β-環糊精的體積比為100︰1，作為初制品，-8℃冷凍干燥濃縮至初制品的1/8～1/10倍，得酶活力為3000～4000U/mL濃縮的酸性木聚糖酶制劑。