[發明專利]以市售的酸性木聚糖酶制備煙草加工的輔助酶制劑及應用

在審

• 申請號: 201610103303.5
• 申請日: 2016-02-25
• 公開（公告）號: CN105647889A
• 公開（公告）日: 2016-06-08
• 發明（設計）人: 韓偉;黃文榮;劉士清;張無敵;尹芳;陳應昆;何寶玉;趙春雷;雷宇;王金浩;王應中;韓夢璇;趙剛
• 申請（專利權）人: 云南萬芳生物技術有限公司
• 主分類號: C12N9/42
• 分類號: C12N9/42;A24B15/30;A24B15/20
• 代理公司: 昆明科陽知識產權代理事務所 53111
• 代理人: 孫山明

技術領域

本發明屬于煙草復烤前添加的可提高煙草品級的酶制劑。

技術背景

木聚糖酶（xylanase）是專一降解半纖維素木聚糖為低聚木糖和木糖的一組酶的總稱，主要有：①β-1,4-D-木聚糖內切酶（EC3.2.1.8），簡稱木聚糖酶，功能是水解木聚糖主鏈內部的1,4-糖苷鍵作用于木聚糖無側枝區產生低聚糖和有側枝的寡聚糖，水解產物主要是木二糖和木寡糖，可使木聚糖溶液的粘度迅速下降。②β-1,4-D-外切木聚糖酶（EC3.2.1.92），從木聚糖的非還原性末端，以單個木糖單位（糖基）為切割單位，水解將木糖殘基（糖基）使之成為木糖，使反應體系因木糖量的增加而還原性也增加。③β-D-木糖苷酶（EC3.2.1.37）為外切酶，是木聚糖類半纖維素徹底降解為單糖的關鍵酶之一，從木聚糖水解后的產物低聚木糖和木二糖的非還原性末端逐一水解切下木糖苷單位形成木糖。該酶能夠水解對-硝基苯-β-D-木糖基（PNPX）等人工底物。因β-1,4-木聚糖外切酶（EC3.2.1.92)也能水解低聚木糖和木二糖使木聚糖徹底降解為木糖，在這點上與β-木糖苷酶（EC3.2.1.37）同屬外切酶的功能相同。在多數資料中未將兩種酶分列說明，僅少數資料明確β-木糖苷酶（EC3.2.1.37）是水解低聚木糖和木二糖的。木糖苷酶存在于細菌和真菌中，一般不分泌到細胞外為胞內酶（劉士清，張無敵，尹芳，等。沼氣發酵實驗教程。北京：化學工業出版社，2013，p114-126，127-138）。大多數微生物產生的木聚糖酶的最適作用pH值在6～7，其中一些微生物能夠產生在較低pH條件下保持較高酶活力和穩定性的耐酸或酸性木聚糖酶，即酸性木聚糖酶，這些微生物的木聚糖酶顯示的酸穩定性，提供了以工業化生產的微生物酸性木聚糖酶市售商品的來源（田永，等，酸性木聚糖酶的應用研究進展，糧油加工，2008，(5):110～113）。

相關專利文獻中，“一種復合酶制劑及將該復合酶制劑用于煙梗生產的工藝”(戴麗君等，ZL2005101044436)研究了淀粉酶、果膠酶和木聚糖酶復合酶制劑，經復合酶處理后的煙梗、梗膏和再造煙葉的水溶性糖含量有較大的變化。但不是單一的酸性木聚糖酶制品。

發明內容

本發明旨在提供以商品化的酶源制備單一的酸性木聚糖酶，用于新鮮煙草烘烤后，對復烤前的片煙用水稀釋替代片煙復烤的自然陳化時原有的第二潤葉用水的煙草活性添加劑，更好地降解煙草中的半纖維素，達到提高煙草品質的作用。

本發明上述目的通過以下方法實現：

（一）以市售的酸性木聚糖酶制備煙草加工的輔助酶制劑

該制劑酸性木聚糖酶的酶活力在50℃和pH4.5下為3000～4000U/mL。

優選的，所述的酶制劑的酸性木聚糖酶的最佳酶活力為3500U/mL。

（二）制備本發明輔助酶制劑的方法

包括以下步驟：

（1）用pH4.5緩沖液溶解蛋白酶活性抑制劑PMSF，PMSF在緩沖液中的濃度為0.01mol/L，再按緩沖液與水的體積比1：4稀釋緩沖液；將市售的酸性木聚糖酶固體物酶源與稀釋緩沖液該兩者按重量體積比1g：10～20mL混勻得混合液，加入NaCl攪拌溶解，混合液與NaCl的重量體積比為0.75g/L；過濾，收集濾液作為待精制處理的粗酶液，靜置。

上述緩沖液為Britton-Robinsion緩沖液；

上述在市售的酸性木聚糖酶固體物酶源中加入pH4.5的稀釋緩沖液的量與酶源的原始酶活力呈正相關；

（2）步驟（1）靜置1h的粗酶液，加入(NH₄)₂SO₄，(NH₄)₂SO₄濃度為25％，緩慢攪拌溶解，靜置2h；繼續按上清液體積加入(NH₄)₂SO₄濃度為至80%，靜置過夜。離心要沉淀。收集的上清液中補加10%(NH₄)₂SO₄，再過夜，重復離心得二次沉淀，合并兩次沉淀；

所述(NH₄)₂SO₄濃度為重量體積比；

（3）配制濃度為0.1%的EDTA溶液，該溶液與沉淀的體積比為1：2；