[發(fā)明專(zhuān)利]一種用于蚋類(lèi)昆蟲(chóng)分類(lèi)和鑒定的引物及其制備方法和應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610101978.6
• 申請(qǐng)日: 2016-02-24
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN105525028A
• 公開(kāi)（公告）日: 2016-04-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王剛;黃敏;黃波;張經(jīng)常
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 西北農(nóng)林科技大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/68
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 北京方圓嘉禾知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11385
• 代理人: 董芙蓉

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種用于蚋類(lèi)昆蟲(chóng)(黑蠅)分類(lèi) 和鑒定的引物及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

蚋蟲(chóng)，屬雙翅目長(zhǎng)角亞目蚋科(Simulidae)，俗稱(chēng)黑蠅(blackfly)、駝背(挖背) 和刨錛。古代又稱(chēng)蜹，是醫(yī)學(xué)昆蟲(chóng)中呈世界性分布的一個(gè)重要類(lèi)群。它不但騷 擾吸血，侵襲人畜，而且是人類(lèi)和禽畜類(lèi)多種疾病的傳播媒介，其中包括人盤(pán) 尾絲蟲(chóng)病(Onchocerciasis)、畜類(lèi)盤(pán)尾絲蟲(chóng)病和由歐氏曼森線蟲(chóng)(Mansoneila Ozzanli)引起的曼森絲蟲(chóng)病及禽鳥(niǎo)住白細(xì)胞蟲(chóng)病(Leucocytozoonsis)等疾病。由于 蚋具群舞習(xí)性，成群地在人頭部飛行騷擾，可引起人情緒波動(dòng)，表現(xiàn)為煩躁不 安、易激怒等。由于蚋類(lèi)個(gè)體較小且種間形態(tài)差異較小，在昆蟲(chóng)分類(lèi)界是分類(lèi) 學(xué)一大挑戰(zhàn)，形態(tài)分類(lèi)局限于國(guó)內(nèi)極少數(shù)專(zhuān)家，不能全面快速地進(jìn)行種類(lèi)鑒別， 對(duì)是否攜帶河盲癥、盤(pán)尾絲蟲(chóng)病原的蚋的分布也不能做出識(shí)別，不能有效地做 出預(yù)警與分析，不能對(duì)防治措施的有效制定提供基本信息及數(shù)據(jù)。

現(xiàn)有針對(duì)蚋類(lèi)昆蟲(chóng)(黑蠅)分類(lèi)和鑒定的引物如COI等在種間表現(xiàn)良好但 在種下表現(xiàn)較差，其他引物如ND4，ITS等也存在應(yīng)用范圍有限，使用效果較 差，操作比較繁瑣等缺點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種用于蚋類(lèi)昆蟲(chóng)(黑蠅)分類(lèi)和鑒定的引物及其 制備方法和應(yīng)用，旨在解決現(xiàn)有針對(duì)蚋類(lèi)昆蟲(chóng)(黑蠅)分類(lèi)和鑒定的引物，應(yīng) 用范圍有限，使用效果較差，操作繁瑣的問(wèn)題。

本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種用于蚋類(lèi)昆蟲(chóng)分類(lèi)和鑒定的引物，所述用于蚋 類(lèi)昆蟲(chóng)分類(lèi)和鑒定的引物序列：

SEQIDNO：1TATGTACTACCATGAGGACAAATATC

SEQIDNO：2AGCAAATAAAAAATATCATTC。

進(jìn)一步，所述用于蚋類(lèi)昆蟲(chóng)分類(lèi)和鑒定的引物片段370bp。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種所述用于蚋類(lèi)昆蟲(chóng)分類(lèi)和鑒定的引物的制 備方法，所述制備方法包括以下步驟：

步驟一，總DNA的提取，采用試劑盒法，用100μL洗脫液溶解提取的樣 品，采用核酸滴定儀測(cè)定提取DNA的濃度及純度，進(jìn)行樣品檢測(cè)或者置于-20℃ 保存、備用；

步驟二，引物篩選，選出備選上游引物13條，下游引物13條，引物序列 SEQIDNO：1與SEQIDNO：2的組合；

步驟三，以所得基因組DNA為模板，利用上述兩對(duì)引物對(duì)基因組DNA中 的線粒體cytb基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增；

步驟四，取適量的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖電泳檢測(cè)結(jié)果，經(jīng)溴化乙錠染色 后于紫外燈下觀察，兩對(duì)引物擴(kuò)增的片段大小分別為400bp，將得到的特異性 產(chǎn)物測(cè)序，利用Chromas2.4軟件讀取測(cè)序結(jié)果。

進(jìn)一步，所述PCR反應(yīng)體系和條件為：PCR反應(yīng)體系為25μL，含2×PCR Mastermix12.5μL，正/反向引物各3μL，DNA模板2μL，含20～50ng DNA，ddH₂O補(bǔ)足25μL；

PCR反應(yīng)條件為：94℃下預(yù)變性2min；而后35個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括 94℃變性30s，41-51℃退火30s，72℃延伸30s；最后72℃延伸5min。

進(jìn)一步，所述蚋類(lèi)分子鑒定引物的使用方法，使用1％瓊脂糖電泳檢測(cè)。

本發(fā)明提供的用于蚋類(lèi)昆蟲(chóng)(黑蠅)分類(lèi)和鑒定的引物及其制備方法和應(yīng) 用，引物cytb組合來(lái)自于ChrisSimon1994，上下游為自己組合，在現(xiàn)有技術(shù)中 引物未被使用也未被應(yīng)用于蚋類(lèi)昆蟲(chóng)(黑蠅)分類(lèi)中去，未見(jiàn)相關(guān)蚋類(lèi)昆蟲(chóng)(黑 蠅)鑒定文章使用過(guò)此引物；本發(fā)明的引物片段約370bp，易擴(kuò)增，在不同種間 的表現(xiàn)良好，相較其他引物，對(duì)于種下分化的表現(xiàn)要優(yōu)異一些；比應(yīng)用于蚋類(lèi) 昆蟲(chóng)(黑蠅)的其他cytb引物比要適用范圍更廣。

本發(fā)明運(yùn)用此引物技術(shù)與現(xiàn)有技術(shù)相比具有：

1、結(jié)果準(zhǔn)確可靠：已經(jīng)對(duì)采自中國(guó)的8種蚋蟲(chóng)進(jìn)行鑒定驗(yàn)證，結(jié)果的可靠 性具有充分的保證。

2、操作簡(jiǎn)便：應(yīng)用本發(fā)明方法，鑒定蚋類(lèi)昆蟲(chóng)，一般的普通實(shí)驗(yàn)人員即可 完成，不需要專(zhuān)業(yè)的形態(tài)學(xué)鑒定知識(shí)。