[發明專利]一種等溫核酸擴增的方法

在審

• 申請號: 201610101384.5
• 申請日: 2016-02-24
• 公開（公告）號: CN107119040A
• 公開（公告）日: 2017-09-01
• 發明（設計）人: 石超;馬翠萍;尚凡金;周美玲;張攀松;王一凡
• 申請（專利權）人: 青島艾菲生物技術有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 北京雙收知識產權代理有限公司11241
• 代理人: 陳磊,孫寧寧

背景技術：

近年來，核酸擴增方法已得到廣泛的關注。目前，聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction,PCR)是體外擴增核酸序列最常用的方法。PCR方法使用少量雙鏈核酸為模板實現指數式擴增，擴增結果使其具有高靈敏度的優點，因此該方法被廣泛的用作克隆或核酸擴增的工具。然而，PCR方法明顯存在以下問題：PCR的每一個循環都包括變性、退火和延伸這三個步驟，因此，必須要用具有精確調控溫度的儀器，在醫院的床邊或戶外難以應用；需要優化復性溫度以提高特異性，工作較繁瑣復雜；反應耗時長；因而滿足不了即時檢測領域中簡單快速的要求。

為克服PCR方法存在的弊端，自20世紀90年代初以來很多實驗室嘗試發展一系列無需熱變性的等溫核酸擴增方法，如鏈置換擴增(Strand Displacement Amplification,SDA)、環介導等溫擴增(Loop Mediated Isothermal Amplification,LAMP)、交叉引物擴增(Cross Priming Amplification,CPA)等，這些方法的共同特點是擴增反應均在一個特定的溫度下簡單快速反應，從而大大的降低了對儀器的要求。

鏈置換擴增(Strand Displacement Amplification,SDA)是由沃克(Walker)等人于1992年開發的一種檢測雙鏈核酸擴增的方法。該方法主要是依賴于限制性內切酶和DNA聚合酶共同作用來完成的。其原理是首先使用熱變性方法將雙鏈DNA轉變為單鏈，含有限制性內切酶識別序列的引物與單鏈模板結合，在DNA聚合酶作用下延伸形成模板的互補鏈，加入的外引物鏈置換下形成的模板互補鏈，另一個帶有限制性酶識別序列的引物與形成的模板互補鏈結合并延伸，實驗中采用硫代的特定堿基，使得內切酶切割雙鏈中的一條鏈產生切口，聚合酶在切口處合成新的鏈并將原先的鏈置換下來同時補平酶切位點，被置換的鏈又與擴增引物互補而開啟循環擴增。鏈置換擴增靈敏性高，可快速擴增獲得單鏈DNA，但是該方法需要初始熱變性的步驟；反應還需限制性內切酶，增加了額外的費用，需要四條引物的參與，體系復雜易引起非特異性反應；檢測手段的局限，限制了它的應用范圍。

環介導等溫擴增(Loop Mediated Isothermal Amplification，LAMP)是由日本學者Notomi等人在2000年建立的一種新的體外擴增核酸特異性序列的方法，該方法主要利用4條特異性引物分別識別目標DNA的6個特定區域，通過2個環狀結構和鏈置換反應實現核酸的快速等溫擴增。LAMP反應過程包括啞鈴狀模板合成階段、循環擴增階段、伸長和再循環階段。該方法反應迅速，有較好的靈敏度和特異性。但是此方法四條引物設計比較困難，需要特殊的設計軟件，對設計人員要求高，易引起氣溶膠污染而導致假陽性結果，并且在檢測中多用于定性而不是定量檢測。上述不足在一定程度上限制了該技術的推廣應用。

交叉引物擴增(Cross Priming Amplification,CPA)是一種恒溫擴增靶核酸序列的方法。該方法主要針對靶基因的5個區域設計5條特異性引物，引物尾端交叉互換序列，利用具有鏈置換活性的DNA聚合酶進行延伸置換，以線性結構或二級結構的方式進行擴增，通過引物的反復雜交、延伸和擴增產物的自我雜交折疊及延伸，產生多個引物雜交位點，使同一模板上可有多個擴增反應同時進行，從而在恒溫條件下完成核酸擴增反應，該方法的優點是不需要模板的熱變性、多次溫度循環過程，反應迅速等。然而，該方法引物比較多，易產生非特異性反應，得到的擴增產物復雜，只能通過瓊脂糖凝膠電泳進行定性檢測而不能進行定量分析。

發明內容

本發明提供一種等溫核酸擴增的方法，來解決現有的等溫核酸擴增的方法需要多引物、多酶、對小片段擴增效果差等問題。

本發明通過設計正向和反向兩條引物，利用雙鏈間的動態解離原理和鏈置換DNA聚合酶的作用在等溫條件下實現信號的多重放大來完成核酸擴增反應，從而建立的一種新型的快速靈敏的核酸擴增方法。

本發明根據專利201510501218.X中提出Bst DNA聚合酶兼有反轉錄和鏈置換活性，可使RNA在其作用下首先反轉錄成cDNA，再利用Bst DNA聚合酶進行鏈置換擴增反應，使得整個體系完全在等溫條件下進行RNA的擴增，無需額外加入反轉錄酶，使反轉錄與擴增實現一體化，減少了酶的用量，且大大縮短了反應時間，同時降低了反應的成本。

為了實現上述目的，一種等溫核酸擴增的方法，包括以下步驟：

(1)設計正向和反向兩條引物；