[發明專利]應用Sso7d-IN融合蛋白進行HIV-1整合酶3′加工抑制劑篩選的方法

在審

• 申請號: 201610100895.5
• 申請日: 2016-02-24
• 公開（公告）號: CN105648031A
• 公開（公告）日: 2016-06-08
• 發明（設計）人: 胡利明;毛志杰;劉偉;劇侖
• 申請（專利權）人: 北京工業大學
• 主分類號: C12Q1/25
• 分類號: C12Q1/25
• 代理公司: 北京思海天達知識產權代理有限公司 11203
• 代理人: 張慧

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體地說是將一種新構建的HIV-1整合酶應用于3′加 工抑制劑體外篩選方法。

背景技術

Sso7d有助于穩定DNA雙螺旋結構并促使DNA構型轉變，Sso7d與IN基因連接，構建 出的Sso7d-IN有較好的溶解性和活性。與野生型整合酶不同的是，它可以更有效的催化整 合體的形成以及與寡核苷酸DNA底物的相關整合過程，并將其應用于對整合酶3′加工抑制 劑的體外篩選。

目前應用于整合酶3′加工抑制劑常用篩選的方法有：

1.分子信標方法

此方法是根據熒光共振能量轉移(fluorescenceresonanceenergytransfer， FRET)設計出的一段具有莖環結構的寡核苷酸鏈，兩端分別偶聯熒光基團和淬滅基團。He根 據此原理，設計了38nt的單鏈DNA底物，退火形成與HIV-1LTRU5相同的序列，在該鏈的5′端 和3′端分別用熒光基團FAM和淬滅基團DABCYL修飾標記。無IN蛋白存在時，FAM和DABCYL空 間距離近時，FAM受激發后發射的熒光被DABCYL吸收淬滅，檢測不到熒光信號；加入IN后，整 合酶特異性識別3′末端的CAGT序列，切下連有DABCYL的GT二核苷酸，FAM與DABCYL的距離變 大，FAM受激發后發射的熒光不再受DABCYL淬滅，激發發射能檢測到熒光信號。如抑制劑的 抑制效果好，熒光強度降低。本發明在此方法基礎上，進行改進，不同的是應用Sso7d-IN代 替IN，提高反應過程中陽性與陰性值間的差異，有利于抑制劑的篩選。(何紅秋.HIV-1整合 酶活性檢測方法建立和應用研究.北京工業大學博士論文.2010)。

2.酶聯免疫吸附法

此方法利用時間分辨熒光(timeresolvedfluoroimmunoassay，TRFIA)分析法篩 選，該方法的原理是：在合成的一段HIV-1LTRU5端DNA3′端標記生物素，將其包被在微孔 板中，加入抑制劑孵育后加入整合酶，將生物素標記的核苷酸被洗掉，加入親和素偶聯的Eu (SA-Eu)，SA-Eu與未剪切的生物素標記的底物序列結合，用時間分辨熒光計可檢測熒光信 號。加入抑制劑后，熒光強度會增強。(張旋,楊柳萌,鄭永唐.HIV-1整合酶抑制劑體外篩選 方法研究進展，中國藥理學通報，2012，28(1):14-17)。

發明內容

本發明的目的是利用一種溶解性和活性更好的整合酶用于3′加工抑制劑的體外 篩選，提高了3′加工反應的活性。

本發明提供的一種應用Sso7d-IN融合蛋白進行HIV-1整合酶3′加工抑制劑篩選的 方法，包括以下步驟：

(1)HIV-1Sso7d-IN整合酶重組蛋白及待測化合物樣品的制備

將合成的Sso7d基因片段與野生型整合酶(integrase,IN)基因分別擴增，通過融 合PCR連接，構建Sso7d-IN表達載體，表達并純化HIV-1Sso7d-IN整合酶重組蛋白，分裝保存 待用；室溫下將待測化合物樣品用二甲基亞砜(DMSO)配制成不同濃度的溶液，充分振蕩溶 解后備用；

(2)DNA底物的制備

用退火緩沖液溶解DNA底物后，PCR儀設定程序94℃2min，每90s下降1℃，約2h后， 底物會自發形成互補雙鏈。上述退火緩沖液含有10mMTris，50mMNaCl，1mMEDTA，pH＝ 8.0；

DNA底物為5′-(FAM)-ACTGCTAGAGATTTTCCACGTGGAAAATCTCTAGCAGT- 3′-(DABCYL)；

(3)待測化合物樣品的篩選