[發明專利]應用Sso7d-IN融合蛋白進行HIV-1整合酶3′加工抑制劑篩選的方法

在審

• 申請號: 201610100895.5
• 申請日: 2016-02-24
• 公開（公告）號: CN105648031A
• 公開（公告）日: 2016-06-08
• 發明（設計）人: 胡利明;毛志杰;劉偉;劇侖
• 申請（專利權）人: 北京工業大學
• 主分類號: C12Q1/25
• 分類號: C12Q1/25
• 代理公司: 北京思海天達知識產權代理有限公司 11203
• 代理人: 張慧

1.一種應用Sso7d-IN融合蛋白進行HIV-1整合酶3′加工抑制劑篩選的方法，包括以下 步驟：

(1)HIV-1Sso7d-IN整合酶重組蛋白的制備

將合成的Sso7d基因片段與野生型整合酶(integrase,IN)基因分別擴增，通過融合PCR 連接，構建Sso7d-IN表達載體，表達并純化HIV-1Sso7d-IN整合酶重組蛋白，分裝保存待用； 室溫下將待測化合物樣品用二甲基亞砜(DMSO)配制成不同濃度的溶液，充分振蕩溶解后備 用；

(2)DNA底物的制備

用退火緩沖液溶解DNA底物后，PCR儀設定程序94℃2min，每90s下降1℃，約2h后，底物 會自發形成互補雙鏈；上述退火緩沖液含有10mMTris，50mMNaCl，1mMEDTA，pH＝8.0；

DNA底物為5′-(FAM)-ACTGCTAGAGATTTTCCACGTGGAAAATCTCTAGCAGT-3′- (DABCYL)；

(3)待測化合物樣品的篩選

反應在96孔不透明微孔板中進行，陽性對照組2孔，每孔分別加2μLDMSO，陰性對照組2 孔，每孔分別加2μLDMSO，其他孔的實驗組中加入2μL不同濃度的待測化合物樣品；除陰性 對照組，其余都加Sso7d-IN；具體操作如下：a、反應體系總體積為100μL，用ddH₂O洗板一次， 然后每孔加入2×反應緩沖液50μL，加入DTT2μL，2.5μg純化的Sso7d-IN整合酶重組蛋白； b、然后陽性對照組的孔和陰性對照組的孔分別2μLDMSO，實驗組的其他孔加入2μL用DMSO 稀釋的待測化合物；然后ddH₂O補足體積；c、與HIV-1Sso7d-IN整合酶重組蛋白在無MnCl₂的 反應緩沖液中37℃孵育30min后，每孔加入終濃度為10mmol/L的Mn²⁺、20pmolDNA底物，混 勻；37℃反應2h，用酶標儀讀取熒光讀值；d、同樣設置了待測化合物與DNA底物組，只加2× 反應緩沖液50μL、20pmolDNA底物、2μL用DMSO稀釋的待測化合物，37℃孵育2h后用酶標儀 讀取熒光讀值；選擇激發光波長為485nm，發射光波長為528nm；上述2×反應緩沖液含有 40mMHEPES、200mMNaCl、50％(g/L)甘油，pH＝7.6；

(4)按照以下公式計算待測樣品的抑制率：

通過測定不同濃度下的待測化合物樣品抑制率可得出待測化合物的IC₅₀值。

2.按照權利要求1的方法，其特征在于，由于有些待測化合物樣品對DNA熒光基團的RFU 值有直接影響，會導致高濃度時待測化合物RFU<陰性對照RFU的情況，因此需要對待測化合 物RFU進行修正，用修正后待測化合物RFU帶入上面的公式進行計算；在上述步驟d中設置待 測化合物樣品與DNA底物組，測定化合物不同濃度下，DNA底物RFU值的變化即下述公式中的 待測化合物樣品與DNA底物組RFU；修正后待測化合物RFU＝待測化合物RFU+(陰性對照RFU- 待測化合物樣品與DNA底物組RFU)，其中待測化合物RFU指的是步驟c中其他孔的實驗組的 待測化合物RFU。