[發(fā)明專利]一種細(xì)胞培養(yǎng)用微載體及其制備方法和應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610100424.4
• 申請日: 2016-02-24
• 公開（公告）號: CN105567626A
• 公開（公告）日: 2016-05-11
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 馬忠仁;李明生;張磊;靳冬武
• 申請（專利權(quán)）人: 馮玉萍;馬忠仁
• 主分類號: C12N5/00
• 分類號: C12N5/00;C08J3/24
• 代理公司: 北京中恒高博知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11249
• 代理人: 呂玉博

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種細(xì)胞培養(yǎng)用微載體及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

動物細(xì)胞生物反應(yīng)器微載體培養(yǎng)技術(shù)是當(dāng)前生物制藥行業(yè)貼壁依賴性細(xì)胞培養(yǎng) 的領(lǐng)先技術(shù)。微載體是細(xì)胞培養(yǎng)中所使用的一類無毒性、非剛性、密度均一、透明的小顆粒。 能使貼壁依賴性細(xì)胞貼附在顆粒表面進行懸浮培養(yǎng)，從而增加細(xì)胞貼附生長的面積，有利 于細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)和收集。

自1967年VanWezel第一個用DEAE-SephadexA50作為貼壁細(xì)胞培養(yǎng)用微載體以 來，研究報道的細(xì)胞培養(yǎng)用微載體已有十多種，包括葡聚糖微載體、聚賴氨酸液體微載體、 大孔明膠微載體、纖維素微載體、殼聚糖微載體、甲殼素微載體、聚苯乙烯微載體、聚氨酯泡 沫微載體、藻酸鹽凝膠微載體以及磁性微載體等。我國目前使用的商品化微載體主要有：如 GE公司的CytodexI、CytodexII、CytodexIII和Thermo公司的Cytopore、Cytoline、 Biosilon、CultispherG等，均為進口產(chǎn)品，但是價格昂貴，目前市場價已達(dá)每公斤3～10萬 元人民幣，還出現(xiàn)供不應(yīng)求的現(xiàn)象，而我國國產(chǎn)的微載體大多數(shù)尚在研制之中，或者生產(chǎn)規(guī) 模較小，難以工業(yè)化生產(chǎn)，不能滿足我國生物制藥領(lǐng)域疫苗、重組藥物蛋白、單克隆抗體、細(xì) 胞因子及其受體等醫(yī)用生物制品生產(chǎn)的需要，是限制我國動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)從轉(zhuǎn)瓶細(xì)胞培 養(yǎng)工藝向生物反應(yīng)器微載體培養(yǎng)工藝轉(zhuǎn)型的技術(shù)瓶頸之一。

目前，在發(fā)達(dá)國家，生物制藥行業(yè)貼壁依賴型動物細(xì)胞培養(yǎng)工藝已普遍采用生物 反應(yīng)器微載體培養(yǎng)工藝，幾千升、上萬升的動物細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器已用于抗體或人用及 獸用疫苗的生產(chǎn)，微載體細(xì)胞培養(yǎng)的規(guī)模已達(dá)到6000L以上。而我國絕大多數(shù)疫苗類制藥行 業(yè)仍然沿用傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)瓶（滾瓶）培養(yǎng)工藝。該工藝勞動強度大，細(xì)胞產(chǎn)量低，產(chǎn)品批向差異 大，且容易造成污染，耗時耗力，導(dǎo)致我國絕大多數(shù)制藥企業(yè)的生物醫(yī)藥產(chǎn)品生產(chǎn)成本高， 產(chǎn)值低，無法與國外產(chǎn)品競爭。要提高產(chǎn)品競爭力，只有采用生物反應(yīng)器微載體大規(guī)模培養(yǎng) 技術(shù)。

因此，開發(fā)適合于我國生物醫(yī)藥領(lǐng)域多種動物細(xì)胞培養(yǎng)用的微載體，具有廣泛的 應(yīng)用前景，對促進我國生物反應(yīng)器微載體大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展具有重要的歷史意 義。

淀粉是一種廉價、易得、綠色的多糖生物材料,被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、紡織等行 業(yè)。淀粉結(jié)構(gòu)中的大量羥基基團為淀粉化學(xué)改性提供了良好載體,已成為最具發(fā)展?jié)摿? 應(yīng)用前景的新型高分子材料之一。以淀粉為原料制備的淀粉微載體，有微孔結(jié)構(gòu)、表面積較 大且富含羥基等易接近的活性基團，因而可以有效吸附自由組分，成為細(xì)胞能夠貼壁生長 的良好原材料，目前，淀粉微載體尚未見報道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供了一種細(xì)胞培養(yǎng)用微載體及其制備方法和應(yīng)用。該制備方法具有以下 特點：采用普通的食用淀粉，原料無毒性，采取乳化成球常溫下交聯(lián)固化，DEAE再次偶聯(lián)修 飾，整個制備過程簡單易行，方法可控，成本低廉，易于形成工業(yè)化生產(chǎn)，使淀粉微載體能夠 在攪拌狀態(tài)下懸浮培養(yǎng)，適合于多種貼壁細(xì)胞大規(guī)模懸浮培養(yǎng)。

本發(fā)明提供一種細(xì)胞培養(yǎng)用微載體的制備方法，步驟如下：

（1）首先配制糊化的淀粉堿溶液：將一定量的淀粉溶解于純水中，攪拌加熱至糊化，再 加入一定量的NaOH溶液，攪拌冷卻形成均一穩(wěn)定的水相溶液；

（2）油水相混合制球：將無毒高密度油、異辛烷、分散劑和一定量的乳化劑混合攪拌，形 成均一的油相溶液后，緩慢加入水相溶液，攪拌，形成均一穩(wěn)定的混合相；

（3）交聯(lián)固化成球：再將交聯(lián)劑緩慢加入到混合相中，常溫下攪拌交聯(lián)反應(yīng)一定時間；

（4）除油洗滌：除去上層的油乳液，將固形物用表面活性劑進行除油，再依次用不含Ca²⁺、Mg²⁺的PBS緩沖液及純水洗滌，抽濾得到濕微球；

（5）偶聯(lián)DEAE-HCl：稱取一定量的濕微球，加入一定濃度的NaOH溶液攪拌，再加入一定 濃度的DEAE-HCl溶液，攪拌偶聯(lián)反應(yīng)一定時間；

（6）洗滌：依次用不含Ca²⁺、Mg²⁺的PBS緩沖液及純水洗滌，得到細(xì)胞培養(yǎng)用微載體；

作為優(yōu)選，步驟（6）后還包括將得到的微載體保存在體積百分濃度為30%的乙醇溶液中 的步驟。