[發明專利]一種細胞培養用微載體及其制備方法和應用

在審

• 申請號: 201610100424.4
• 申請日: 2016-02-24
• 公開（公告）號: CN105567626A
• 公開（公告）日: 2016-05-11
• 發明（設計）人: 馬忠仁;李明生;張磊;靳冬武
• 申請（專利權）人: 馮玉萍;馬忠仁
• 主分類號: C12N5/00
• 分類號: C12N5/00;C08J3/24
• 代理公司: 北京中恒高博知識產權代理有限公司 11249
• 代理人: 呂玉博

1.一種細胞培養用微載體的制備方法，其特征在于：步驟如下：

（1）首先配制糊化的淀粉堿溶液：將一定量的淀粉溶解于純水中，攪拌加熱至糊化，再 加入一定量的NaOH溶液，攪拌冷卻形成均一穩定的水相溶液；

（2）油水相混合制球：將無毒高密度油、異辛烷、分散劑和一定量的乳化劑混合攪拌，形 成均一的油相溶液后，緩慢加入水相溶液，攪拌，形成均一穩定的混合相；

（3）交聯固化成球：再將交聯劑緩慢加入到混合相中，常溫下攪拌交聯反應一定時間；

（4）除油洗滌：除去上層的油乳液，將固形物用表面活性劑進行除油，再依次用不含Ca²⁺、Mg²⁺的PBS緩沖液及純水洗滌，抽濾得到濕微球；

（5）偶聯DEAE-HCl：稱取一定量的濕微球，加入一定濃度的NaOH溶液攪拌，再加入一定 濃度的DEAE-HCl溶液，攪拌偶聯反應一定時間；

（6）洗滌：依次用不含Ca²⁺、Mg²⁺的PBS緩沖液及純水洗滌，得到細胞培養用微載體；

作為優選，步驟（6）后還包括將得到的微載體保存在體積百分濃度為30%的乙醇溶液中 的步驟。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟（1）中，所述淀粉為木薯淀粉、馬鈴薯 淀粉、大豆淀粉、玉米淀粉中的一個或者任意兩者的組合；

作為優選，所述NaOH溶液的濃度為0.5～2mol/L；

作為優選，所述水相溶液中，淀粉的質量體積百分比為0.1%～15%。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟（2）中，所述無毒高密度油為礦物油或 植物油；

作為優選，所述無毒高密度油為液體石蠟、機油、汽油、硅油、花生油、玉米油或大豆油；

作為優選，所述水相和油相的體積比為1:1～10；

作為優選，所述的乳化劑和分散劑為Span-20、Span-40、Span-60、Span-80、Tween-20、 Tween-40、Tween-60、Tween-80中的一種或者任意兩者的組合；

作為優選，所述油相中乳化劑和分散劑的體積濃度為0.1%～5%。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟（3）中，所述的交聯劑為戊二醛、聚乙 二醇縮水甘油醚、聚丙二醇二縮水甘油醚、馬來酸酐、戊二酸酐、丁二酸酐、氮丙啶中的一 種；

作為優選，所述的交聯劑用量為水相溶液體積的3%～20%；

作為進一步優選，所述的交聯劑用量為水相溶液體積的8%～12%；

作為優選，所述的交聯攪拌速度為200～1000rpm，反應時間為2～10小時；

作為進一步優選，所述的交聯攪拌速度為400～700rpm，反應時間為4～8小時。

5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟（4）中，所述的表面活性劑的質量濃度 為1～5%；

作為優選，所述表面活性劑為Tween-20、Tween-40、Tween-60、Tween-80、TRITON-100或 OP-10中的一種。

6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟（5）中，所述的濕微球的質量、NaOH溶 液的體積和DEAE-HCl溶液的體積三者之間的比值為1:1～4:1～4；

作為優選，所述NaOH溶液的濃度為0.5～4mol/L，DEAE-HCl的濃度為1～5mol/L；

作為優選，所述偶聯反應的速度為400～800rpm，偶聯溫度60～80℃，交聯時間為2～6 小時。

7.根據權利要求1-6任一所述的方法，其特征在于：所述步驟（6）后還將得到的微載體 篩分的步驟，取粒徑在100～400μm的微載體；

作為優選，取粒徑在200～300μm的微載體；

作為進一步優選，在篩分后還包括滅菌的步驟；所述滅菌是將微載體洗凈之后，用高壓 蒸汽滅菌或用75%酒精浸泡滅菌，或用Co60輻照滅菌。