[發明專利]豆粉中黃曲霉定性標準樣品及其制備方法有效
| 申請號： | 201610099671.7 | 申請日： | 2016-02-23 |
| 公開（公告）號： | CN105734125B | 公開（公告）日： | 2021-01-12 |
| 發明（設計）人： | 劉淑艷;蔣丹;萬超;孫曉飛;白璐;鄭江 | 申請（專利權）人： | 劉淑艷;蔣丹;萬超;孫曉飛 |
| 主分類號： | C12Q1/6895 | 分類號： | C12Q1/6895;C12Q1/04;C12N15/54;C12N15/53;C12N15/31;C12N15/11;C12R1/67 |
| 代理公司： | 大連瑞博晟知識產權代理有限公司 21259 | 代理人： | 于忠晶 |
| 地址： | 116000 遼寧*** | 國省代碼： | 遼寧;21 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 豆粉 中黃 曲霉 定性 標準 樣品 及其 制備 方法 | ||
1.一種豆粉中黃曲霉定性標準樣品，其特征在于：所述豆粉中黃曲霉定性標準樣品的溯源指標如下表所示：
表1 豆粉中黃曲霉定性標準樣品溯源指標
；
所述產毒基因簇為aflR基因、Aflt1基因、Aflt2基因、Nor-1基因、Omt-1基因、Ver-1基因；
所述豆粉中黃曲霉定性標準樣品包含的序列為：
內轉錄間隔區基因（ITS）序列：
TCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTACCGAGTGTAGGGTTCCTAGCGAGCCCAACCTCCCACCCGTGTTTACTGTACCTTAGTTGCTTCGGCGGGCCCGCCATTCATGGCCGCCGGGGGCTCTCAGCCCCGGGCCCGCGCCCGCCGGAGACACCACGAACTCTGTCTGATCTAGTGAAGTCTGAGTTGATTGTATCGCAATCAGTTAAAACTTTCAACAATGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAACTAGTGTGAATTGCAGAATTCCGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTGCTGCCCATCAAGCACGGCTTGTGTGTTGGGTCGTCGTCCCCTCTCCGGGGGGGACGGGCCCCAAAGGCAGCGGCGGCACCGCGTCCGATCCTCGAGCGTATGGGGCTTTGTCACCCGCTCTGTAGGCCCGGCCGGCGCTTGCCGAACGCAAATCAATCTTTTCCAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGA；
核糖體rRNA 18S基因（18S）序列：
GTAGTCATATGCTTGTCTCAAAGATTAAGCCATGCATGTCTAAGTATAAGCACTTTATACTGTGAAACTGCGAATGGCTCATTAAATCAGTTATCGTTTATTTGATAGTACCTTACTACATGGATACCTGTGGTAATTCTAGAGCTAATACATGCTAAAAACCTCGACTTCGGAAGGGGTGTATTTATTAGATAAAAAACCAATGCCCTTCGGGGCTCCTTGGTGATTCATAATAACTTAACGAATCGCATGGCCTTGCGCCGGCGATGGTTCATTCAAATTTCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTAGGATAGTGGCCTACCATGGTGGCAACGGGTAACGGGGAATTAGGGTTCGATTCCGGAGAGGGAGCCTGAGAAACGGCTACCACATCCAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATCCCGACACGGGGAGGTAGTGACAATAAATACTGATACGGGGCTCTTTTGGGTCTCGTAATTGGAATGAGTACAATCTAAATCCCTTAACGAGGAACAATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATATTAAAGTTGTTGCAGTTAAAAAGCTCGTAGTTGAACCTTGGGTCTGGCTGGCCGGTCCGCCTCACCGCGAGTACTGGTCCGGCTGGACCTTTCCTTCTGGGGAACCTCATGGCCTTCACTGGCTGTGGGGGGAACCAGGACTTTTACTGTGAAAAAATTAGAGTGTTCAAAGCAGGCCTTTGCTCGAATACATTAGCATGGAATAATAGAATAGGACGTGCGGTTCTATTTTGTTGGTTTCTAGGACCGCCGTAATGATTAATAGGGATAGTCGGGGGCGTCAGTATTCAGCTGTCAGAGGTGAAATTCTTGGATTTGCTGAAGACTAACTACTGCGAAAGCATTCGCCAAGGATGTTTTCATTAATCAGGGAACGAAAGTTAGGGGATCGAAGACGATCAGATACCGTCGTAGTCTTAACCATAAACTATGCCGACTAGGGATCGGGCGGTGTTTCTATGATGACCCGCTCGGCACCTTACGAGAAATCAAAGTTTTTGGGTTCTGGGGGGAGTATGGTCGCAAGGCTGAAACTTAAAGGAATTGACGGAAG；
核糖體rRNA 28S基因（28S）序列：
GTGAAATTGTTGAAAGGGAAGCGCTTGCGACCAGACTCGCCTCCAGGGTTCAGCCGGCATTCGTGCCGGTGTACTTCCCTGGGGGCGGGCCAGCGTCGGTTTGGGCGGCCGGTCAAAGGCTCCCGGAATGTAGTGCCCTCCGGGGCACCTTATAGCCGGGAGTGCAATGCGGCCAGCCTGGACCGAGGAACGCGCTTCGGCACGGACGCTGGCATAATGGTCGTAAACGACCCGTCTTGAAACACGGACCAAGGAGTC；
轉錄調節子編碼基因（aflR）序列：
CGCGCGAGATACTTCTTATACTAAACCTCGAATTGCCATTCCACTGACGACCGGCGGGGGAGGACAGCCTTCCAATTACTATATGGCAAGTTATATGCCCTCTTCAGCACCAAATGGGTCTTTCTCGTCGCCCTGGGTATTTTCGAAGTGGGCTC；
易化子超家族轉運蛋白基因（Aflt1）序列：
GCACCAAATGGGTCTTTCTCGTCGCCCTGGGTATTTTCGAAGTGGGCTCTCTGATCTGCGGCGTCGCACCGTCGTCCGTAGTTCTCATCGTCGGCCGTGCCATCGCGGGAGTGGGGAGCTCGGGGATCTTTACAGGTGCTCTGGTCACCATGCGGCATATTGTGCCCTTGGCCAAGCGACCAGTTTACATGGGGCTCTTGGGGGGGATGTACGGGATTGCGTCAGTGGCAGGCCCTCTGGTAAGTCACCGTTGATGCACCCGGCGGCTGTGACGGGCACCATTAACCGTTCCTTGTGAATCGCAGTTGGGGGGCGCCTTCACGAACGAAGTGACCTGGCGATGGTGCTTCTACATCAATCTTCCGGTCGGAGGGGTCACCGCTGTGGTTATCCTGTTTCTTCTTCGGATCCCCAAATCGGCGGACCTGCGCACGCATGGCGCCTGGGAGATGTTGAAAGGCTTAGATCCGTTAGGCACGATTGTCTTCACCCCGTCCATCATCTGCGTTCTCCTGGCGCTCCAGTGGGGTGGGGTGGACTACGCTTGGTCGAATGGACGCATTATCGCGCTGTTTGTTCTCTTCGGCGTGCTCCTCATCACATTTATCGTCATTCAGGTCCTCATGAAGGATAACGCCACCGGTATGGTATTCCTCCGTTGGTTTCCATCCGTTCTGTAAGCCTCGCTCACCACTCCCGCCAGTACCGATCAAAGTAGCCTCTCAGCGATCCGTAGCATGCGCCTCCGTCTTCGTCTTCTTCATCGGCGCCTCCATGTTCGTGATGATCTACTATGTGCCGATCTGGGTAACCTGCCTCTCCCTAGTCCCCTCCCTGTGTGATGTGTCGCACCACGCCACGATATTGCTAATGCATATCCAATAGTTCCAAGCCATTCGCAACCAATCACCCGTGCAGGCAGGCATTGATTCTATTGCCTTGATTTTGGCCAATACCGCCGGTGCCATCATCTCTGGCGCCGTGACCAATAAGACAGGGCACTACGCCCACTGGTTTATTGTCAGTAGCGTGATCATGTCGATTGGCGCCGGCTGCCTTACCCTCTTCACCGTGGAT；
易化子超家族轉運蛋白基因（Aflt2）序列：
CGCGCGAGATACTTCTTATACTAAACCTCGAATTGCCATTCCACTGACGACCGGCGGGGGAGGACAGCCTTCCAATTACTATATGGCAAGTTATATGCCCTCTTCAGCACCAAATGGGTCTTTCTCGTCGCCCTGGGTATTTTCGAAGTGGGCTC；
降散盤衣酸還原酶基因（Nor-1）序列：
ACCGCTACGCCGGCGCTCTCGGCACTAACCGTCGCTGAAGGCAGTCGGATGATCATAGTGCAGCTTAACTGCGACTCGGAAACTGATGCCCAGGCAGCCGTCCAGACATTGCGGGAGGAGCACGGGGTGACGCACTTGGACGTGGTGGTTGCCAATGCGGCCATGGCGACGAACTTTGGGCCCGCGTCCACCATGCCCCTCGAGCATCTCCAGGCACACATGATGGTCAACATGTATGCTCCCGTCCTACTGTTTCAGGCAACCCGCCTGATGCTGCAGCAGTCCAAGCAACAGGCCAAGTTTGTCTTGATCGGCGCCCCGATCAGCACCATCACCAACATGCACGACTATGCGCGGGCCCCACTGACGGCGTACGGAGTGTCGAAGCTGGCGGCCAAC；
柄曲霉素轉甲氧基酶基因（Omt-1）序列：
GTGGACGGACCTAGTCCGACATCACTCGACACAATCGTCGCCGCGACCGGAGTCTCCGAGGATTTACTACGTATGAGCTTCCATGTCTATAGGTCATCCACTGAAAGGCAGTGCATTAATCAATATTCAGGACGGATTCTTCGAGGATGTGCCCAGCGCTTCATCTTTGAGGAGGTTGCCCCTGACCAATACGCCCACACAGATGCCTCAAAGATGCTGCGAGTGACGGGTATTCATGCCTTGGTTGGATTCTCGTGAGTCTCCTTCTTTAACAATAAACTACCAGATGTCCTCACCAGGGAGACCGAGTTAGATGTGACGAAGTGATGCGGTCGGGTGCCTACTTTTCCGACTTCTTGCAGCAGACGAAAGGCAAACCTCCGAGTTGGAATGTGCCTTCACCTTTCTCATTGGCATTTGATCGTAGGTATTCCACTCTATCTAGATAGGAACGCAGCTGAAATGCGAGAAACAGCTACCAAAGGGCTATTTGACTATTACAGCACTGTGGACGAGGTTCGCGGCCGCCGCTTTGATCTAGGTATGGGTGGCACCGAAGCCACGAAGCCACTGGTAGAGGAGATGTTTGATTTCGACAGTCTACCTGAGGGGAGCACCGTTGTCGATGTGGGCGGCGGTCGTGGTCATCTCAGCCGACGGGTTTCGCAAAAGCATCCCCACCTCAGGTTCATCGTACAGGACCTGCCTGCCGTCATTCACGGAGTTGAGGACACTGATAAAGTCACCATGATGGAGCATGACATTCGGCGCCCCAACCCAGTGCGTGGCGCCGAC；
雜色曲霉素A脫氫酶基因(Ver-1)序列：
TGAACTACGCCCACTCCCGGGAGGCCGCGGAGAAGGTAGTTCAACAGATCAAGGCCAACGGCACCGACGCTATCGCAATCCAGGCCGATGTCGGGGATCCTGAGGCGACGGCGAAGTTAATGGCGGAGACGGTGCGCCATTTTGGCTACCTGGACATTGTGTCATCGAACGCTGGAATTGTATCGTTCGGTCACCTGAAAGACGTGACCCCAGAAGTATGAACCACAGATAACGCATTCAAGGCATATGCTAATGAAAACATTAGGAGTTTGACCGGGTCTTCCGGGTCAACACTCGTGGCCAGTTCTTCGTGGCGCGGGAGGCCTATCGCCATATGCGGGAAGGAGGCCGGATTATCCTGACCAGCTCTAACACCGCTTGCGTCAAAGGGGTACCCAAGCATGCTGTATACTCCGGGTCCAAAGGAGCTATTGACACCTTTGTTCGCTGCATGGCCATTGACTGCGGAGACAAGAAAATCACCGTGAATGCGGTGGCTCCTGGAGCCATCAAGACTGATATGTTTTTGCCTGTGTCGCGGGAGTATATCCCC；
所述的豆粉中黃曲霉定性標準樣品通過以下方法制備：
第一步：培養黃曲霉ATCC28539至對數生長期，采集孢子加入到10-30 mL的0.5%的豆粉水溶液中，目標菌添加量約為2× 105CFU/mL；
第二步：樣品置于干凈無菌袋中，混合儀拍打混合，再將混勻好的上述溶液加入到總體的豆粉水溶液中，重復混合步驟；
第三步：將步驟二中制備好的菌液分裝0.5mL/瓶，放置橡膠蓋，但不要塞緊，置于中試凍干機中低溫真空冷凍干燥，制備成混合凍干粉；
冷凍工藝參數如下：
1）預冷階段：隔板溫度5℃；
2）冷凍階段：設置隔板溫度為10℃，每個階段降低10℃，至-50℃，每個溫度階段運行時間分別為1h；
3）主干燥階段：隔板溫度-50℃，運行時間0.5h，真空度0.2mbar；隔板溫度-40℃，運行時間7h，真空度0.4mbar；隔板溫度-35℃，運行時間7h，真空度0.6mbar；隔板溫度-25℃，運行時間5h，真空度0.8mbar；隔板溫度-15℃，運行時間4h，真空度1.0mbar；隔板溫度-5℃，運行時間2h，真空度1.2mbar；
4）二次干燥階段：隔板溫度0℃，運行時間3h，真空度0.0010mbar； 隔板溫度15℃，運行時間3h，真空度0.0010mbar；隔板溫度25℃，運行時間3h，真空度0.0010mbar。
2.一種根據權利要求1所述的豆粉中黃曲霉定性標準樣品的制備方法，其特征在于：包括以下步驟：
第一步：培養黃曲霉ATCC28539至對數生長期，采集孢子加入到10-30 mL的0.5%的豆粉水溶液中，目標菌添加量約為2× 105CFU/mL；
第二步：樣品置于干凈無菌袋中，混合儀拍打混合，再將混勻好的上述溶液加入到總體的豆粉水溶液中，重復混合步驟；
第三步：將步驟二中制備好的菌液分裝0.5mL/瓶，放置橡膠蓋，但不要塞緊，置于中試凍干機中低溫真空冷凍干燥，制備成混合凍干粉；
所述第三步中的冷凍工藝參數如下：
1）預冷階段：隔板溫度5℃；
2）冷凍階段：設置隔板溫度為10℃，每個階段降低10℃，至-50℃，每個溫度階段運行時間分別為1h；
3）主干燥階段：隔板溫度-50℃，運行時間0.5h，真空度0.2mbar；隔板溫度-40℃，運行時間7h，真空度0.4mbar；隔板溫度-35℃，運行時間7h，真空度0.6mbar；隔板溫度-25℃，運行時間5h，真空度0.8mbar；隔板溫度-15℃，運行時間4h，真空度1.0mbar；隔板溫度-5℃，運行時間2h，真空度1.2mbar；
4）二次干燥階段：隔板溫度0℃，運行時間3h，真空度0.0010mbar； 隔板溫度15℃，運行時間3h，真空度0.0010mbar；隔板溫度25℃，運行時間3h，真空度0.0010mbar。
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