[發明專利]一種發酵生產桿菌肽的方法

無效

• 申請號: 201610097983.4
• 申請日: 2016-02-23
• 公開（公告）號: CN105483064A
• 公開（公告）日: 2016-04-13
• 發明（設計）人: 任風芝;張雪霞;王耀耀;耿文飛;鄭智慧;楊海靜;高任龍;段寶玲;張煒
• 申請（專利權）人: 華北制藥集團新藥研究開發有限責任公司
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12P21/00;C12R1/10
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于發酵工程領域，具體涉及一種發酵生產桿菌肽的方法。

背景技術

桿菌肽是一種由12種氨基酸組成的噻唑肽類窄譜抗生素，主要由特雷斯氏枯草桿 菌和地衣芽孢桿菌發酵產生，對革蘭氏陽性球菌和桿菌有效，對少數革蘭氏陰性菌、螺旋體 及放線菌也有一定的抑制作用。桿菌肽具有高效、低毒、殘留量少等優點。因此，桿菌肽不僅 是一種重要的抗生素藥物，也是安全性良好的畜禽抗生素飼料添加劑。

桿菌肽是幾種相似多肽組分的混合物，含有桿菌肽A、B1、B2、B3、C1、C2、C3、E、F等 化學結構類似的異構體，其主要活性成分為桿菌肽A，分子式為C₆₆H₁₀₃N₁₇O₁₆S。桿菌肽F是桿 菌肽A的降解產物，有腎毒性，需嚴格控制其含量。

桿菌肽是類白色至淡黃色的粉末，無嗅、味苦，有吸濕性，易被氧化劑破壞，在溶液 中能被多種重金屬鹽類沉淀，桿菌肽在水中易溶，在乙醇中溶解，在丙酮、三氯甲烷或乙醚 中不溶。

桿菌肽是肽類抗生素，由一系列氨基酸通過酶催化合成，因而氮代謝對桿菌肽的 合成影響明顯。而目前的有機氮源大多為大宗農副產品，其質量受產地、加工方式等影響， 造成不同發酵批次間菌種的次級代謝水平不一致，進而影響下游純化，最終影響產品質量。

酵母粉和棉籽蛋白粉，是近年發展起來的有機氮源。其中棉籽蛋白粉是一種以特 定地區的優質棉籽為原料，采用先進的技術生產的高蛋白、低酚、低纖維、微生物利用效果 好的有機氮源，產品的蛋白含量在50%以上，氨基酸組成占總氮的90%以上，游離棉酚的含量 控制在600ppm以下，產品質量穩定。酵母粉為標準化有機氮源，蛋白質含量高（蛋白質占干 菌體總重50%以上），含有18種氨基酸，種類齊全，維生素和礦物質等含量豐富。但未見有報 道將兩種有機氮源配合應用于地衣芽孢桿菌生物合成桿菌肽。

桿菌肽為微生物發酵的次級代謝產物，存在于發酵液中，桿菌肽不僅對其他生物 有殺死或抑制作用，對產生菌自身也有殺死或抑制作用。隨著桿菌肽在發酵液中濃度不斷 增高，其產生菌受到高濃度產物的反饋調節作用，使產生菌生物細胞及酶的潛力不能充分 發揮，造成桿菌肽的產率難以提高，從而成為制約提高桿菌肽發酵水平的瓶頸。選育能耐受 高濃度桿菌肽的產生菌固然可以使生產指標得以提高，但并不能從根本上解決問題。

發明內容

本發明的目的是解決現有技術中微生物發酵制備桿菌肽存在的發酵過程不穩定 及發酵水平低的問題，提供一種通過優化發酵培養基配方、發酵條件來提高桿菌肽產量的 方法。

本發明所提供的一種發酵生產桿菌肽的方法，包括以下步驟：

a、制備地衣芽孢桿菌菌株的種子液

將地衣芽孢桿菌菌株的斜面培養物接種于種子培養基，28-30℃、200-240rpm，培養 20-28h獲得種子液；

其中所述的種子培養基按以下方法制得：玉米淀粉3.0-5.0克、葡萄糖10.0-20.0克、酵 母粉10.0-20.0克、硫酸銨1.0-2.0克、氯化鈉1.0-2.0克、七水硫酸鎂1.0-1.5克，加水定容 至1000mL，pH6.5-7.0，121℃滅菌30min。

本發明所述桿菌肽產生菌可選用菌株ATCC10716。

b、制備地衣芽孢桿菌菌株的發酵液

將上述種子液以體積百分比6-10%的接種量接種于發酵培養基，在搖瓶或發酵罐中發 酵，發酵時間72-96h，發酵溫度28-30℃，得到發酵液；

其中所述發酵培養基按以下方法制得：玉米淀粉30.0-40.0克、葡萄糖10.0-20.0克、棉 籽蛋白粉15.0-30.0克、酵母粉10.0-20.0克、硫酸銨2.0-3.0克、玉米漿3.0-5.0克、磷酸二 氫鉀1.0-1.5克、氯化鈉2.0-3.0克、七水硫酸鎂1.0-2.0克，加水定容至1000mL，pH6.5-7.0， 121℃滅菌30min。

本發明的進一步改進在于：其中有機氮源中棉籽蛋白粉和酵母粉添加比例為3:2。

本發明的進一步改進在于：其中步驟b中發酵15-25小時之間添加經過滅菌后的超 順磁性微球，繼續發酵，總發酵時間72-96h。