[發明專利]一種胃泌素釋放肽前體蛋白表達載體的構建、單抗及試劑盒的制備方法

在審

• 申請號: 201610095916.9
• 申請日: 2016-02-22
• 公開（公告）號: CN105567724A
• 公開（公告）日: 2016-05-11
• 發明（設計）人: 沈鶴霄;華權高;馬峰;馬婷;徐春雷
• 申請（專利權）人: 武漢華美生物工程有限公司
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/66;C07K16/26;G01N33/74;G01N33/577;G01N33/543;G01N33/532
• 代理公司: 北京華沛德權律師事務所 11302
• 代理人: 房德權

技術領域

本發明涉及免疫學測定分析領域，特別涉及一種胃泌素釋放肽前體蛋白表達 載體的構建、單抗及試劑盒的制備方法。

背景技術

胃泌素釋放肽前體(ProGRP)是小細胞肺癌的一個非常可靠的指標，具有 很好的靈敏度和特異性。肺癌早期無癥狀和癥狀輕微，2/3的患者在發現時已處 于擴散階段，五年存活率小于5％，如能早期發現，通過手術治療，五年存活率 高達70％－80％，ProGRP在小細胞肺癌早期就有可測濃度的分泌，所以該標志 物毫無疑問能用于高危患者的篩查。

ProGRP的釋放不僅更多見于小細胞肺癌的癌細胞，而且還發現其在腫瘤和 器官的特異性方面優于其他生物標志物。ProGRP具有強大的鑒別診斷能力是因 為良性病變時ProGRP的產生量很少，其他癌癥(非小細胞癌癥和非神經內分泌 癌癥)中也沒有ProGRP產生，或者產生量很少。ProGRP在預測復發及轉移可 能性方面的表現要優于NSE，并能取代NSE對小細胞肺癌的治療進行監測。

但是，單純大腸表達的ProGRP免疫原是半抗原，免疫原性很差，后期嘗試 過將重組表達的ProGRP化學偶聯大分子載體蛋白BSA或者KLH結構免疫活性 也是很差。

人體正常狀態下少量表達HSP，其含量僅占總蛋白5％～10％，而且受自 身免疫調節網絡作用，不會引起免疫應答反應。當病原體感染機體時，病原體相 對抗體及其機體針對病原體均可合成HSP，二者HSP同源性高于50％，由此 構成HSP在不同個體中介導抗感染免疫或自身免疫反應的基礎。

熱激蛋白融合表達蛋白是一種能增強所融合表達的蛋白免疫效果的一種表 達方法，但這種方法存在篩選抗體時用到的抗原需要另外制備的問題，且往往需 要額外的制備純的蛋白來進行抗體篩選；而未采用融合表達的方法制備出的抗體 效價往往不高，需要很長時間才能篩選出較高效價的單抗。

發明內容

針對現有技術中的上述問題，本發明的目的是提供一種胃泌素釋放肽前體蛋 白表達載體的構建，能夠通過一次克隆表達，制備出高免疫原性的ProGRP和 HSPA6融合蛋白，ProGRP-HSPA6融合蛋白既可以作為免疫原，也可以很方便的 通過一步酶切制備出不含表達標簽的純ProGRP用于單抗鑒定及抗體篩選的蛋白 抗原。

本發明的另一目的是提供一種利用上述胃泌素釋放肽前體蛋白表達載體制 備單抗的方法，利用ProGRP-HSPA6融合蛋白做為免疫原提高了免疫原性，增加 了免疫效果，很大程度的提高了抗體制備和篩選效率。

本發明的另一目的是提供一種胃泌素釋放肽化學發光試劑盒的制備方法，試 劑盒的制備周期短，所述試劑盒應用雙抗體夾心法測定標本中胃泌素釋放肽前體 (ProGRP)水平，可以進行雙抗體夾心法的磁粒子化學發光檢測樣本。

為了達到上述目的，本發明采用如下技術方案：一種胃泌素釋放肽前體蛋白 表達載體的構建，包括如下步驟：

在HSPA6蛋白基因上引入腸激酶酶切位點序列，通過酶切位點將帶腸激酶 酶切位點的HSPA6克隆到載體上，得到中間表達載體；再通過酶切位點將ProGRP 目的基因克隆到所述中間表達載體上，以構建得到ProGRP-HSPA6目的表達載 體。

作為進一步的優選，通過BamHI/NotI雙酶切位點將帶腸激酶酶切位點的 HSPA6克隆到載體上。

作為進一步的優選，通過NadI/BamHI雙酶切位點將ProGRP目的基因克隆 到所述中間表達載體上。

作為進一步的優選，所述中間表達載體為PET-28a-HSPA6表達載體，所述 目的表達載體為PET-28a-ProGRP-HSPA6表達載體。

作為進一步的優選，根據uniprot蛋白數據庫的基因序列合成ProGRP基因 片段。

利用上述胃泌素釋放肽前體蛋白表達載體制備單抗的方法，包括如下步驟：

1)將ProGRP-HSPA6表達載體導入宿主；

2)采用IPTG誘導表達融合蛋白；

3)鎳離子柱純化得高純度蛋白做為免疫原；

4)免疫動物；

5)取所述免疫動物的細胞制備融合細胞；篩選分泌單抗的雜交瘤細胞系， 建立單抗細胞株，并制備單抗腹水。