[發明專利]一種胃泌素釋放肽前體蛋白表達載體的構建、單抗及試劑盒的制備方法

在審

• 申請號: 201610095916.9
• 申請日: 2016-02-22
• 公開（公告）號: CN105567724A
• 公開（公告）日: 2016-05-11
• 發明（設計）人: 沈鶴霄;華權高;馬峰;馬婷;徐春雷
• 申請（專利權）人: 武漢華美生物工程有限公司
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/66;C07K16/26;G01N33/74;G01N33/577;G01N33/543;G01N33/532
• 代理公司: 北京華沛德權律師事務所 11302
• 代理人: 房德權

1.一種胃泌素釋放肽前體蛋白表達載體的構建，其特征在于：包括如下步 驟：

在HSPA6蛋白基因上引入腸激酶酶切位點序列，通過酶切位點將帶腸激酶 酶切位點的HSPA6克隆到載體上，得到中間表達載體；通過酶切位點將ProGRP 目的基因克隆到所述中間表達載體上，構建得到ProGRP-HSPA6目的表達載體。

2.根據權利要求1所述的胃泌素釋放肽前體蛋白表達載體的構建，其特征 在于：通過BamHI/NotI雙酶切位點將帶腸激酶酶切位點的HSPA6克隆到載體 上。

3.根據權利要求1所述的胃泌素釋放肽前體蛋白表達載體的構建，其特征 在于：通過NadI/BamHI雙酶切位點將ProGRP目的基因克隆到所述中間表達載 體上。

4.根據權利要求1所述的胃泌素釋放肽前體蛋白表達載體的構建，其特征 在于：所述中間表達載體為PET-28a-HSPA6表達載體，所述目的表達載體為 PET-28a-ProGRP-HSPA6表達載體。

5.利用權利要求1-4任一項所述的胃泌素釋放肽前體蛋白表達載體制備單 抗的方法，其特征在于：包括如下步驟：

1)將ProGRP-HSPA6表達載體導入宿主；

2)采用IPTG誘導表達融合蛋白；

3)鎳離子柱純化得高純度蛋白做為免疫原；

4)免疫動物；

5)取所述免疫動物的細胞制備融合細胞；篩選分泌單抗的雜交瘤細胞系， 建立單抗細胞株，并制備單抗腹水。

6.根據權利要求5所述的制備單抗的方法，其特征在于：還包括步驟6) 抗體的篩選：利用腸激酶切掉HSPA6+ProGRP融合蛋白的HSPA6標簽部分，得 到純的ProGRP來篩選所述單抗。

7.一種胃泌素釋放肽化學發光試劑盒的制備方法，其特征在于：包括如下 步驟：

利用吖啶酯標記一如權利要求5或6所述的Pro-GRP單克隆抗體；

將另一如權利要求5或6所述的Pro-GRP單克隆抗體偶聯磁粒子；

將樣本、磁粒子偶聯的所述Pro-GRP單克隆抗體及吖啶酯標記的所述 Pro-GRP單克隆抗體進行反應，形成抗體一抗原一抗體夾心復合體，制作成化學 發光試劑盒用于樣本檢測。

8.根據權利要求7所述的胃泌素釋放肽化學發光試劑盒的制備方法，其特 征在于：吖啶酯標記所述Pro-GRP單克隆抗體具體步驟如下：取一定量Pro-GRP 單克隆抗體，采用0.05mol/LpH9.5CB調整濃度為1mg/mL；按抗體：吖啶 酯＝1：10～20摩爾比加入已活化吖啶酯，室溫反應0.5～1.0h；將反應液移至 透析袋，采用0.05mol/LpH9.5CB透析24h，加人等量甘油，放置～20℃以 下保存。

9.根據權利要求7所述的胃泌素釋放肽化學發光試劑盒的制備方法，其特 征在于：將所述單克隆抗體偶聯磁粒子具體步驟如下：將磁粒子用50mmol/L NaCO₃-NaHCO₃pH9.6緩沖液稀釋至適當濃度，按1mL磁粒子加1mL抗體的 比例進行固相，4℃攪拌過夜，磁分離器分離磁粒子，用pH7.4PBS反復洗滌3 次，加5g/LBSA封閉4℃攪伴過夜，磁分離器分離磁粒子，用pH7.4PBS洗3 次，加入磁微粒穩定劑，使微球濃度為5mg/mL。

10.根據權利要求7所述的胃泌素釋放肽化學發光試劑盒的制備方法，其 特征在于：樣本檢測步驟如下：將形成的所述抗體一抗原一抗體夾心復合體反應 液置于一個磁場內，檢測中的磁粒子將被吸附，通過洗滌，將未結合物沖洗除去； 注入第一化學發光激發液及第二化學發光激發液，檢測其化學發光光子強度，用 雙對數法，以發光值對Pro-GRP濃度作圖，通過標準曲線對血清Pro-GRP濃度 進行測定。